單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)與腫瘤免疫微環(huán)境lncRNAs研究

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）在腫瘤發(fā)生和免疫應(yīng)答中起著重要作用。迄今為止，大多數(shù)lncRNA研究嚴(yán)重依賴于Bulk RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，即各種不同細(xì)胞類型的平均信號(hào)，這限制了細(xì)胞特異性lncRNA功能的發(fā)現(xiàn)。盡管缺乏低豐度細(xì)胞特異性lncRNA的注釋，單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）仍是一個(gè)潛在的解決方案。因此，進(jìn)一步分析lncRNA的不同細(xì)胞特征表達(dá)和注釋在研究lncRNA參與腫瘤免疫微環(huán)境中是必要的。


1.總結(jié)大量腫瘤研究中與癌癥發(fā)展、進(jìn)展和腫瘤抑制有關(guān)的功能性lncRNAs的信息。
2.概述當(dāng)前癌癥和免疫相關(guān)的lncRNAs在細(xì)胞水平上的真實(shí)表達(dá)以及l(fā)ncRNAs在TIME中可能具有的細(xì)胞功能的知識(shí)。
3.討論單細(xì)胞分析在研究TIME lncRNAs的細(xì)胞功能方面的前景和挑戰(zhàn)。

本文著重對(duì)單細(xì)胞技術(shù)在研究TIME lncRNAs的細(xì)胞功能方面進(jìn)行導(dǎo)讀。

TIME lncRNAs的單細(xì)胞分析 

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序允許在單細(xì)胞水平上檢測(cè)新的lncRNAs標(biāo)記或其功能。Kim等人分析來自體細(xì)胞不同重編程階段的單細(xì)胞數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)lncRNAs集顯示重編程過程中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。Bocchi等人從發(fā)育中的人類紋狀體產(chǎn)生Bulk和單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)新的lncRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

當(dāng)前，有研究使用單細(xì)胞分析深入研究了腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞之間的交互。然而，大多數(shù)研究都集中在蛋白質(zhì)編碼基因（PCGs）上。只有少數(shù)人對(duì)lncRNAs進(jìn)行了分析。Lee等人使用單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)觀察到lncRNAs在轉(zhuǎn)移性透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）中的特定作用。作者發(fā)現(xiàn)共有173個(gè)lncRNAs與ccRCC轉(zhuǎn)移相關(guān)，并將它們命名為ccRCC轉(zhuǎn)移相關(guān)lncRNAs（CMALs）�；�于CMALs和PCGs之間的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，CMALs似乎有助于細(xì)胞粘附、免疫反應(yīng)和細(xì)胞增殖，其中12種通過特異性調(diào)節(jié)TNF和HIF1信號(hào)通路來促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移。盡管全球?qū)用娴膯渭?xì)胞lncRNAs研究很少見，但Lnc2Cancer 3.0或LnCeCell等數(shù)據(jù)庫提供了全面的概述，尤其是針對(duì)細(xì)胞特異性lncRNA相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)和RNA-RNA相互作用。lncRNA的單細(xì)胞研究數(shù)量如此有限的原因包括細(xì)胞類型特異性lncRNAs的注釋不完整以及它們?cè)赥IME中的表達(dá)相對(duì)較低。因此，TIME lncRNAs的綜合圖譜將是鑒定TIME中功能性lncRNAs的重要資源。


scRNA-seq的一般程序


通過比較bulk和單細(xì)胞水平的標(biāo)記分析可知：bulk RNA-seq主要捕獲在大量腫瘤樣本中差異表達(dá)的lncRNAs標(biāo)記，而與細(xì)胞類型組成無關(guān)。scRNA-seq捕獲特定于某些細(xì)胞類型的lncRNAs標(biāo)記物以及特定于腫瘤特定細(xì)胞類型的標(biāo)記物。

用于lncRNAs研究的單細(xì)胞平臺(tái)

基于液滴的方法（例如10x或Dropseq）在帶有poly-A尾的RNA的3'-末端或在5'-末端產(chǎn)生單細(xì)胞讀數(shù)RNAs，因此需要使用高置信度的基因末端位置來正確量化lncRNAs。由于lncRNAs的豐度低，一些lncRNAs序列僅部分組裝，所以目前基因注釋中沒有全長(zhǎng)序列�；�于板的方法（例如SMART-seq2）按細(xì)胞對(duì)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序。與3'-end scRNA-seq相比，全長(zhǎng)scRNA-seq通常從更少的細(xì)胞中捕獲信息，所以讀取覆蓋率和每個(gè)細(xì)胞的基因數(shù)量通常遠(yuǎn)高于3'-end scRNA-seq，可以說全長(zhǎng)scRNA-seq為識(shí)別TIME中的細(xì)胞類型特異性lncRNAs提供了一種更靈敏的方法。

利用公開的肺癌scRNA-seq數(shù)據(jù)集對(duì)兩個(gè)有代表性的單細(xì)胞平臺(tái)：10x Chromium 3’-seq（10x）和SMARTseq2（SS2）在lncRNAs檢測(cè)的敏感性方面進(jìn)行了比較。大約37.6%和65.4%的lncRNAs（以bulk RNA-seq數(shù)據(jù)表示）也分別在10x和SS2平臺(tái)中以相似的水平[≥1個(gè)轉(zhuǎn)錄本（TPM）]檢測(cè)到。



單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)集中基因的TPM分布，這些基因在每個(gè)scRNA-seq平臺(tái)中的TCGA（肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌，10X，肺腺癌，SS2）中以≥1 TPM檢測(cè)到。

在10x和SS2平臺(tái)中分別可檢測(cè)到約74.9%和98.2%（≥0.1 TPM）。正如預(yù)期的那樣，盡管敏感性取決于測(cè)序深度，SS2似乎對(duì)lncRNAs的檢測(cè)更敏感。單細(xì)胞水平的腫瘤和非腫瘤樣本之間的差異表達(dá)基因（single cell DEGs）可能與整體水平的差異表達(dá)基因（DEGs）不同，主要是因?yàn)閱渭?xì)胞DEGs存在于細(xì)胞水平。事實(shí)上，超過一半的細(xì)胞類型特異性腫瘤/非腫瘤標(biāo)志物（10x為63.64%，SS2為66.67%）僅在scRNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，表明對(duì)于TIME中的主要和次要細(xì)胞類型，scRNA-seq對(duì)標(biāo)志物的檢測(cè)將更具特異性。




腫瘤和非腫瘤樣本中單細(xì)胞DEG lncRNAs的比例與來自大量RNA-seq數(shù)據(jù)或偽大量RNA-seq數(shù)據(jù)的比例重疊。通過比較來自每種細(xì)胞類型的腫瘤和非腫瘤樣品的單細(xì)胞之間的基因表達(dá)，獲得單細(xì)胞DEGs。通過比較來自成對(duì)腫瘤和非腫瘤樣本的大量RNA-seq數(shù)據(jù)之間的基因表達(dá)以及分別從來自腫瘤和非腫瘤組織的scRNA-seq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換而來的偽大量數(shù)據(jù)之間的基因表達(dá)，獲得大量和偽大量DEGs。


Bulk DEGs分析僅概括了15.2%和30.9%的單細(xì)胞DEGs，表明SS2對(duì)DEGs的檢測(cè)也更敏感。然而，SS2在反義轉(zhuǎn)錄本的準(zhǔn)確定量方面存在局限性，因?yàn)镾S2產(chǎn)生的讀數(shù)沒有鏈特異性信息。SS2的更新版本SMART seq3現(xiàn)在提供鏈特異性信息并且可以更準(zhǔn)確地量化反義轉(zhuǎn)錄本。因此，先前在大量腫瘤樣本中研究的許多l(xiāng)ncRNAs的細(xì)胞類型特異性表達(dá)和功能可以使用各種可用的scRNA seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證（見下表）。這一過程可以提供關(guān)于TIME特定細(xì)胞類型中已知和新的lncRNAs功能和調(diào)節(jié)作用的新見解。




結(jié)論 

lncRNAs通過多種調(diào)控機(jī)制在癌癥和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，在TIME中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)和功能表征幾乎沒有在單細(xì)胞水平上進(jìn)行研究，主要是由于lncRNAs的細(xì)胞類型特異性高以及缺乏細(xì)胞類型特異性lncRNAs注釋。單細(xì)胞技術(shù)和相關(guān)生物信息學(xué)工具的更新以及不斷改進(jìn)lncRNAs的細(xì)胞類型特異性注釋將有助于克服目前對(duì)此類RNA進(jìn)行scRNA-seq分析的局限性。這一成就將開啟一個(gè)新的篇章，揭示TIME在惡性細(xì)胞和浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞中表達(dá)的臨床相關(guān)lncRNAs，并彌合先前研究的空白。