近紅外二區(qū)光敏劑使超靈敏成像引導(dǎo)手術(shù)和光療能完全抑制原位肝腫瘤

本文要點(diǎn)：原發(fā)性肝腫瘤的準(zhǔn)確診斷和有效治療具有重要意義，光學(xué)成像已廣泛應(yīng)用于臨床影像引導(dǎo)下的肝腫瘤手術(shù)。第二近紅外窗口(NIR-II)發(fā)射的AIEgen光敏劑以其更高分辨率的生物成像和更深的穿透性而備受關(guān)注。NIR-II聚集誘導(dǎo)發(fā)光物質(zhì)(AIEgen)光敏劑在影像引導(dǎo)手術(shù)/光療中具有更好的光療效果和準(zhǔn)確性。在此，本文提出了一種NIR-II AIEgen光熱消融點(diǎn)，用于NIR-II影像引導(dǎo)下的原位肝腫瘤切除手術(shù)和光療。與吲哚青綠(ICG)相比，AIEgen斑點(diǎn)在1250 nm處表現(xiàn)出明亮而銳利的近紅外(NIR-II)發(fā)射，并延伸到1600 nm處，具有很高的光穩(wěn)定性。此外，AIEgen DOTS有效地產(chǎn)生了用于光動力治療的活性氧(ROS)。對體內(nèi)和體外原位肝腫瘤的研究表明，AIEgen DOTS既可以用于早期腫瘤的影像引導(dǎo)腫瘤手術(shù)，也可以用于“降級”縮小腫瘤大小的意圖。此外，該治療策略完全抑制了原位腫瘤，無復(fù)發(fā)，副作用少。
 

 

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方案1 NIR-II發(fā)射型AIEgen光敏劑PTZ-TQ的示意圖，該光敏劑能夠?qū)崿F(xiàn)超靈敏的成像引導(dǎo)手術(shù)和光療以完全抑制原位肝腫瘤
 

圖1 a)PTZ-TQ分子的合成路線b)PTZ-TQ在四氫呋喃(THF)和水體積分?jǐn)?shù)(FW)為95%的THF/H2O中的b)吸收光譜c)PTZ-TQ在THF/H2O(FW，0%~95%)中的發(fā)射d)發(fā)射強(qiáng)度比(I/I0),根據(jù)PTZ-TQ在不同F(xiàn)W下的(c)計算e)PTZ-TQ在四氫呋喃/水(FW，95%)和純四氫呋喃中的近紅外-II熒光圖像f)經(jīng)1%脂質(zhì)體溶液檢測PTZ-TQ和ICG的信號強(qiáng)度g)計算了PTZ-TQ的HOMO和LOMO

 

圖2 a) PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的TEM圖像b)水中PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的尺寸分布c)PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在水溶液中的UV-Vis-NIR吸收光譜和NIR-II熒光發(fā)射光譜d)PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在間歇808 nm激光(0.25W/cm2)照射60min下在PBS、FBS和DMEM中的光穩(wěn)定性.e)吸光度和f)在808 nm激光(0.25W/cm2)連續(xù)照射30min下的NIR-II熒光發(fā)射g)PTZ-TQ-AIE在水中的 NIR-II熒光圖像h)PTZ-TQ-AIE和ICG通過不同濃度的1%磷脂溶液的信號強(qiáng)度

 

首先，采用納米沉淀法制備了PTZ-TQ-AIE點(diǎn)。透射電子顯微鏡(TEM)測得PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的尺寸約為80 nm，動態(tài)光散射(DLS)分析測得其尺寸約為255 nm(圖2A，b)，水溶液中PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的UV-VIS-NIR吸收光譜和NIR-II熒光發(fā)射光譜表明，675 nm處的吸收峰擴(kuò)展到900 nm，1150 nm處的熒光發(fā)射峰和發(fā)射尾部的熒光發(fā)射峰擴(kuò)展到接近1600 nm(圖2C)。在808 nm激光激發(fā)下，水溶液中PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的量子產(chǎn)額(QY)為0.3%。PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在PBS、FBS和DMEM介質(zhì)中表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性。當(dāng)用功率密度為0.25W/cm~2的808 nm激光連續(xù)照射PTZ-TQ-AIE點(diǎn)30min時，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的吸收和發(fā)射光譜沒有明顯變化(圖2D，e)。此外，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在磷酸鹽緩沖液(PBS)、培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清(FBS)中的發(fā)光強(qiáng)度在相同密度下連續(xù)照射60min后沒有變化(圖2F)。PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的光穩(wěn)定性遠(yuǎn)好于商品化的ICG染料，表明PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)具有良好的體內(nèi)長期熒光成像潛力。

 

接著，用不同的濾光片測量了NIR-IIb的熒光強(qiáng)度。PTZ-TQ-AIE點(diǎn)顯示出比PTZ-TQ(FW=95%)(圖2G)更好的NIR-IIa(1000-1300nm)和NIRIIb(1400-1700 nm)熒光信號。此外，在1050 nm的熒光穿透深度表明，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在8毫米的深度可以分辨出更銳利的毛細(xì)管邊緣；在相同的條件下，ICG只在4毫米的深度顯示出類似的分辨率(圖2H)。
 

圖3 電子順磁共振(EPR)譜檢測1O2的產(chǎn)生a)記錄不同濃度(0~30μg/mL)的Ptz-TQ-AIE點(diǎn)的1O2探針的b)熒光光譜(實(shí)線：激光照射，虛線：不照射),不同時間照射下，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)氧探針的c)熒光強(qiáng)度d)DCFH-DA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生e)鈣黃綠素-AM(活細(xì)胞的綠色熒光)和PI(死亡細(xì)胞的紅色熒光)共染色的HepG2細(xì)胞的E熒光圖像f)PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)與808 nm近紅外激光(0.25W/cm2)孵育24小時后對LO2細(xì)胞、HepG2細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用

 

接下來，用二氯二氫化熒光素二乙酸酯評價了PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的活性氧生成能力以DCFH-DA)作為指標(biāo)。在PTZ-TQ-AIE點(diǎn)(808 nm，0.25W/cm2)存在下，DCFH-DA的熒光隨照射時間的延長而急劇增加。為了進(jìn)一步驗證，電子順磁共振(EPR)被用來驗證ROS的產(chǎn)生。在5 mm的活性氧指示劑TEMPONE與PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在溶液中孵育后，然后照射5分鐘進(jìn)行EPR測量，當(dāng)添加β-胡蘿卜素時EPR信號減少(圖3A)，證明了1O2的有效產(chǎn)生。為了了解生成的物種，首次使用單線態(tài)氧傳感器綠(SOSG)來評估1O2的生成。在PTZ-TQ-AIE點(diǎn)(808 nm，0.25W/cm2)照射下，SOSG的熒光隨照射時間的增加而急劇增加，證實(shí)1O2是主要的活性氧(圖3B，c)。由于PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)具有優(yōu)良的近紅外發(fā)射和活性氧產(chǎn)生能力，因此研究了該斑點(diǎn)在癌癥診斷和治療中的應(yīng)用潛力。如圖3D所示，在輻射下，PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)加激光組顯示DCFH-DA的亮綠色熒光，表明ROS的產(chǎn)生被有效地誘導(dǎo)，并通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生進(jìn)行了定量。ROS的有效產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞死亡(圖3e)。然而，只有輻照或PTZ-TQ-AIE點(diǎn)顯示出可以忽略的紅色熒光，這表明PTZ-TQ-AIE點(diǎn)具有良好的生物相容性，單獨(dú)激光照射的危害有限(圖3e)。以正常肝細(xì)胞為對照，體外細(xì)胞毒性實(shí)驗表明，在100μg/mL濃度下，PTZTQ-AIE dots對正常細(xì)胞和癌細(xì)胞幾乎沒有明顯的毒性作用。3F)。此外，PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)和輻射導(dǎo)致細(xì)胞存活率顯著降低，證明了體外光動力療法(PDT)療效，且PTZ-TQAIE點(diǎn)劑本身副作用較小。
 

圖4 a)在尾靜脈注射PTZ-TQ-AIE點(diǎn)后120s、300s和15min的活體長期后肢血管NIR-II成像b)根據(jù)(a)(120秒)中沿黃線測量的橫截面強(qiáng)度剖面測量的血管半高寬寬度，峰值擬合為高斯函數(shù)c)尾靜脈注射PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)后不同時間點(diǎn)，取原位肝癌大鼠不同時間點(diǎn)的活體長期近紅外熒光圖像，白色圓圈表示腫瘤。d）肝臟和腫瘤的圖像e)NIR-II光學(xué)成像引導(dǎo)腫瘤切除圖示f)NIR-II和生物發(fā)光成像在手術(shù)中的應(yīng)用g)荷瘤小鼠的相對腫瘤生長曲線及相應(yīng)的熒光強(qiáng)度h)肝解剖治療后的照片

 

然后，為了進(jìn)一步研究PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的近紅外成像和光動力學(xué)治療能力，首次對PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的體內(nèi)生物相容性和生物分布進(jìn)行了評價。給健康BALB/c小鼠靜脈注射PTZ-TQ-AIE點(diǎn)(2 00μL，5 0 0μg/mL)后，采集血樣，進(jìn)行分析，主要血細(xì)胞計數(shù)無明顯變化，提示PTZ-TQ-AIE點(diǎn)具有良好的生物相容性。PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)在肝臟和脾臟中有較高的蓄積，表明PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的清除途徑是通過肝膽系統(tǒng)。與ICG相比，PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的血液循環(huán)半衰期相對較長，為61±21分鐘，然后對PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的血管成像性能進(jìn)行了研究。注射后2分鐘、5分鐘和15分鐘通過NIR-II成像可以清楚地顯示血管系統(tǒng)(圖4A)。此外，后肢血管的分辨率(711.8μm)是通過測量高斯擬合的半高寬(FWHM)(圖4B)達(dá)到的，這將足以用于外科手術(shù)。

 

為了評價深部組織的成像和治療，建立了裸鼠原位肝腫瘤模型。將螢火蟲熒光素酶基因轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞，經(jīng)剖腹接種于肝右葉。在確認(rèn)成功建立原位肝腫瘤后，將PTZTQ-AIE斑點(diǎn)(200μL，500μg/mL)靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)。在808 nm激光的激發(fā)下，正常肝臟和腫瘤部位的NIR-II熒光被連續(xù)記錄。在注射后2h，離體結(jié)果顯示腫瘤部位的NIR-II熒光信號低于正常肝組織；腫瘤中較低的NIR-II信號清楚地識別了腫瘤與正常肝器官之間的邊界，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在注射后48小時達(dá)到最大(圖4C，注射后48h，腫瘤區(qū)域可見明亮銳利的NIR-II信號。NIR-II熒光成像的信噪比(SNR)隨時間逐漸增加，48h達(dá)到最大值。為了進(jìn)一步確定腫瘤的位置，在注射后96h拍攝了整個肝組織（圖4D)；定位與在活體NIR-II圖像上觀察到的位置一致(圖4C中的圓圈)。這些結(jié)果表明，在注射后2h通過負(fù)強(qiáng)化或在注射后48h通過正強(qiáng)化可以清楚地識別腫瘤與正常肝器官之間的邊界。因此，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在注射后2h和48h均可用于影像引導(dǎo)手術(shù)，可根據(jù)腫瘤大小提供個性化的治療選擇。

 

鑒于PTZ-TQ-AIE點(diǎn)是較強(qiáng)的活性氧發(fā)生器，研究了PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在光動力治療中應(yīng)用的可行性，以縮小腫瘤的體積，以便進(jìn)一步手術(shù)切除，防止腫瘤的復(fù)發(fā)。因此，采用了不同的治療方法：對于較大的腫瘤，先進(jìn)行PDT治療以縮小腫瘤體積，然后進(jìn)行手術(shù)以最大限度地減少治療過程中對肝臟的損傷(稱為PDT+手術(shù))；對于較小的腫瘤，先進(jìn)行手術(shù)，然后對殘留的腫瘤進(jìn)行PDT治療(稱為手術(shù)+PDT)。治療過程由BLI監(jiān)測，用總BLI強(qiáng)度和相對腫瘤生長來總結(jié)不同治療方法下的腫瘤生長情況。如圖4G所示，對照組(PBS、PBS+激光和PTZ-TQ-AIE點(diǎn))的BLI信號迅速增加，表明腫瘤生長速度較快。單一的治療過程(PDT或手術(shù))導(dǎo)致BLI信號顯著降低，證明了單一影像引導(dǎo)手術(shù)或PDT在腫瘤治療中的有效性。然而，兩個單一治療過程中的腫瘤隨著時間的推移而復(fù)發(fā)(圖4G中的綠色和粉紅色曲線)。早期治療取得了與單一治療過程相似的療效，但在觀察期內(nèi)無腫瘤復(fù)發(fā)(圖4G中紫色和深藍(lán)色曲線)。

 

最后模擬了一個不適合手術(shù)的大型肝癌模型(圖4G中的紫色曲線)。在臨床環(huán)境中，“降級”意圖包括預(yù)處理以減小活躍腫瘤的大小或數(shù)量。首先使用PDT來減小尺寸，PDT治療后，BLI信號在治療后第7天急劇下降，然后進(jìn)行手術(shù)以實(shí)現(xiàn)幾乎完全的腫瘤抑制(圖中紫色曲線。4G)。體內(nèi)肝臟的磁共振成像(MRI)和體外照片證實(shí)，多種治療組幾乎沒有腫瘤結(jié)節(jié)(圖4h）。

 

參考文獻(xiàn)

JiaR, Xu H, Wang C, Su L, Jing J, Xu S, Zhou Y, Sun W, Song J, Chen X, Chen H.NIR-II emissive AIEgen photosensitizers enable ultrasensitive imaging-guidedsurgery and phototherapy to fully inhibit orthotopic hepatic tumors. JNanobiotechnology.

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近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system 

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機(jī)，活體穿透深度高于15mm

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多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴(kuò)展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

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