GFP抗體在蛋白質(zhì)標(biāo)記應(yīng)用中的常見(jiàn)問(wèn)題

標(biāo)簽：抗體  蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 科學(xué)  科普 GFP抗體

GFP適合于蛋白質(zhì)標(biāo)記，這是該抗體的天然優(yōu)勢(shì)。雖然它非常適合實(shí)時(shí)成像，例如，作為 TP53 MITE-seq 屏幕的報(bào)告器，其他應(yīng)用導(dǎo)致 GFP 熒光猝滅，這使得有必要使用抗 GFP 抗體。組織樣本的冷凍保存、組織學(xué)制備和固定劑的使用通常會(huì)導(dǎo)致 GFP 熒光完全或部分喪失，因此需要使用抗 GFP 抗體來(lái)獲得可靠的結(jié)果。

通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) GFP 標(biāo)記的蛋白質(zhì)和通過(guò)免疫沉淀研究蛋白質(zhì) -蛋白質(zhì)相互作用也需要使用 GFP 抗體�？笹FP抗體可用作多克隆或單克隆抗體，適用于在蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)定位和免疫吸附測(cè)定 (ELISA) 上檢測(cè) GFP、GFP 變體和 GFP 融合蛋白。

GFP的分子結(jié)構(gòu)與特征
GFP 形成一個(gè)比較穩(wěn)定的桶形結(jié)構(gòu)，由圍繞中央 α 螺旋的 11 個(gè) β折疊組成。β 表通過(guò)富含脯氨酸的環(huán)連接。每個(gè)片層中的氨基酸側(cè)鏈交替突出到蛋白質(zhì)內(nèi)部或從表面向外突出。GFP 發(fā)色團(tuán)由 Ser65、Tyr66 和 Gly67 的分子內(nèi)環(huán)化形成，它幾乎位于環(huán) 的中心。盡管這三個(gè)氨基酸基序在自然界中很常見(jiàn)，但它不會(huì)產(chǎn)生熒光。

正是 GFP β-獨(dú)特的內(nèi)部環(huán)境產(chǎn)生了發(fā)色團(tuán)并保護(hù)它免于猝滅。發(fā)色團(tuán)的形成是自催化的。GFP 以 Max激發(fā)波長(zhǎng)為 395 nm 的主要質(zhì)子化狀態(tài)和具有 475 nm 激發(fā)峰的不那么普遍的非質(zhì)子化狀態(tài)存在。兩種形式的熒光發(fā)射均在 510 nm 處達(dá)到峰值。

抗 GFP 抗體是否也識(shí)別 GFP 的變體？
抗 GFP 抗體可識(shí)別 Aequorea victoria GFP 的其他變體。
為什么在蛋白質(zhì)印跡上沒(méi)有抗 GFP 抗體的信號(hào)？

蛋白質(zhì)印跡后缺乏信號(hào)可能表明存在一些不同的問(wèn)題。沒(méi)有或非常差的傳輸意味著沒(méi)有信號(hào)。可以通過(guò) Ponceau-S 染色檢查缺乏良好的膜轉(zhuǎn)移。氣泡的存在也會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)印不良。GFP 標(biāo)記蛋白的表達(dá)水平可能太低。加載更大體積的樣品并包括陽(yáng)性對(duì)照。非常稀釋的抗體可能是問(wèn)題所在，嘗試使用幾種不同濃度的抗體來(lái)探測(cè)蛋白質(zhì)印跡。此外，一種遙遠(yuǎn)的可能性是 GFP 標(biāo)簽超出幀并且未表達(dá)，導(dǎo)致缺少任何信號(hào)。

GFP信號(hào)太弱無(wú)法成像，可以增強(qiáng)信號(hào)嗎？
在某些實(shí)驗(yàn)條件下，GFP 熒光會(huì)部分或完全丟失。因此，一些表達(dá) GFP 標(biāo)記蛋白的細(xì)胞結(jié)構(gòu)可能難以可視化或成像。 GFP-Booster 是一種源自駱駝科動(dòng)物的 VHH 結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白，與強(qiáng)熒光染料偶聯(lián)。這穩(wěn)定并增強(qiáng)了熒光信號(hào)。

為什么用抗 GFP抗體進(jìn)行免疫沉淀后會(huì)觀察到多個(gè)條帶？
抗體交叉反應(yīng)是一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題，通常會(huì)導(dǎo)致比預(yù)期更多的條帶。更嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件可能會(huì)解決這個(gè)問(wèn)題。GFP-Trap 可用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。GFP-Trap 是一種單域抗體（源自駱駝科動(dòng)物），具有更高的特異性、穩(wěn)定性和親和力。然而，必須考慮到，如果產(chǎn)生了截短的融合蛋白，如果存在標(biāo)簽，這些也將被抗體檢測(cè)到，并導(dǎo)致多個(gè)條帶。