單細胞核測序技術(shù)在抗抑郁藥物治療的時間反應(yīng)研究中的應(yīng)用

經(jīng)常emo？抑郁癥要數(shù)月治療才可能有效果！

       什么是emo？emo一詞最初指代一種搖滾音樂類型“情緒硬核”（Emotional Hardcore），但在當(dāng)今互聯(lián)網(wǎng)語境中，它更多是作為 emotional的縮寫，被用來指代平日中會時不時出現(xiàn)的情緒化時刻，無人理解的苦惱、加班到深夜的委屈、囊中羞澀的尷尬、一地雞毛的生活瑣事等，“我頹了”、“我抑郁了”、“我太難了”、“我網(wǎng)抑云了”、……即一切“心情不好”的瞬間。emo往往是一種現(xiàn)時情緒，很快就會消逝，并不會讓人長時間沉浸其中。
      而抑郁癥則不同，既存在精神心理癥狀，同時也伴有一系列的生理不適。其發(fā)作往往會有持續(xù)兩周以上的心情低落、思維遲緩、意志活動減退、認知功能損害，以及睡眠障礙、乏力、食欲減退等軀體不適癥狀。據(jù)估計，全球有3.5億人患有抑郁癥。而通常的處方抗抑郁藥，如選擇性血清素再攝取抑制劑(SSRIs)需要數(shù)周甚至數(shù)月才能達到治療效果。為什么抗抑郁藥物需要數(shù)周或數(shù)月才能逆轉(zhuǎn)抑郁情緒，其潛在機制尚不清楚。
      一篇發(fā)表在bioRxiv上題為“Neuron-Glia Signaling Regulates the Onset of the Antidepressant Response”的預(yù)印本文章，利用10x Genomics單細胞核測序技術(shù)，分析了應(yīng)激性抑郁小鼠的基因表達變化，并確定了它們對大腦皮層抗抑郁藥物治療的時間反應(yīng)，以及促進抗抑郁藥物反應(yīng)發(fā)生的細胞類型，從而為減輕抗抑郁藥物治療延遲發(fā)生提供新的研究思路。


       選擇性血清素再攝取抑制劑(SSRIs)由于其安全性、有效性和耐受性，已被用于治療抑郁癥的一線藥物數(shù)十年，并被批準(zhǔn)用于成人和兒童患者。SSRIs對三分之二的重度抑郁癥(MDD)患者有效，用幾周時間可以改善情緒。在這期間，患者會出現(xiàn)多種副作用，其中自殺意念是最主要的。對重度抑郁癥患者的尸檢和神經(jīng)影像學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在抑郁癥病理生理學(xué)過程中，關(guān)鍵神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)存在結(jié)構(gòu)和功能障礙。已知在嚙齒類動物模型中，抗抑郁藥物能在治療后數(shù)小時內(nèi)提高細胞外血清素水平，并被認為能通過誘導(dǎo)長期的神經(jīng)元適應(yīng)來逆轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)和功能異常，如神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元形態(tài)改變和突觸可塑性。在人類和嚙齒類動物模型中，則需要數(shù)周時間通過這些適應(yīng)來改善情緒，這表明在反應(yīng)開始時存在更廣泛的、保守的血清素依賴機制，而這些機制尚不清楚。
不同類型的大腦皮層細胞對壓力和抗抑郁藥物治療有反應(yīng)
       為了確定抗抑郁藥物反應(yīng)中導(dǎo)致數(shù)周延遲的機制，研究人員使用來自小鼠大腦皮層的單細胞核RNA測序(snRNAseq)，利用10x Genomics平臺分析了應(yīng)激和抗抑郁治療后基因表達變化的時間動態(tài)。大腦皮層是皮質(zhì)邊緣情緒回路的一個重要區(qū)域。小鼠被置于社會隔離的環(huán)境中，培養(yǎng)壓力以誘發(fā)類似抑郁的行為，并用氟西汀(fluoxetine，一種廣泛使用的選擇性血清素再攝取抑制劑/SSRI)處理。在治療早期(3天)、一周(7天)和接近觀察到的行為改善(10天)時，分析不同組的基因表達變化。將12周齡小鼠大腦皮層解剖，每個時間點共采集24個樣本，分為4個實驗組：Control, ControlFlx, Stress和StressFlx，每個實驗組6只動物。每個樣本處理5000個細胞核。通過蔗糖偏好測試，壓力大的動物表現(xiàn)出快感缺乏，當(dāng)測量它們的聲音驚嚇反應(yīng)時，它們的情緒狀態(tài)顯示出了更高的驚嚇反應(yīng)。為了確定基因表達的變化，研究者首先收集了所有時間點和治療組的綜合數(shù)據(jù)集。然后，研究人員根據(jù)在每個亞群中富集的相應(yīng)標(biāo)記基因來鑒定細胞群，并在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中回顧細胞類型特異性標(biāo)記基因表達模式，確定了36個不同的亞群。研究者觀察到，隨著治療的時間進程，應(yīng)激影響的氟西汀規(guī)范化基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控穩(wěn)步增加。值得注意的是，如治療第3、7和10天的火山圖所示，研究者發(fā)現(xiàn)應(yīng)激誘導(dǎo)的變化正常化發(fā)生在膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和神經(jīng)元間的細胞群中。

應(yīng)激和氟西汀治療后神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞群的轉(zhuǎn)錄變化
       接下來，研究者通過基因本體論(GO)分析，在個體膠質(zhì)和神經(jīng)元細胞群體水平上分析了應(yīng)激影響氟西汀正�；�基因的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在抗抑郁藥物的早期反應(yīng)中，神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元群體都參與了。少突膠質(zhì)細胞前體(OPC)細胞在治療第7天也有顯著差異表達。最后，在治療第10天，多個神經(jīng)元群體、表達小清蛋白(PV)的中間神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和成熟少突膠質(zhì)細胞的基因表達發(fā)生變化。成熟少突膠質(zhì)細胞僅在治療第10天發(fā)生變化。與多個神經(jīng)元群體的改變同時發(fā)生。這些觀察表明，神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元群體對氟西汀治療有高度組織性的反應(yīng)。

     
     為了進一步描述細胞類型的特定功能，研究者確定了神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元群體中調(diào)節(jié)應(yīng)激影響氟西汀調(diào)節(jié)基因的上游調(diào)節(jié)因子，并確定了群特異性的潛在調(diào)節(jié)因子，如TCF7L2、RxRB、VEGF、BDNF和FGF2，這些分子此前已被證明在嚙齒動物模型的應(yīng)激反應(yīng)、抑郁樣行為和抗抑郁反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用。這些分子在神經(jīng)元可塑性和重塑通路中有已知的功能，證實了長期的神經(jīng)元適應(yīng)需要一定的時間�？偟膩碚f，這些結(jié)果支持了一種可能性，即神經(jīng)膠質(zhì)細胞的早期變化支持了晚期神經(jīng)元適應(yīng)，有助于改善行為。


代表氟西汀反應(yīng)的分子標(biāo)記
       接下來，研究者確定膠質(zhì)細胞功能是否支持導(dǎo)致抗抑郁反應(yīng)的晚期神經(jīng)元適應(yīng)。研究者選擇了時間標(biāo)記來跟蹤氟西汀反應(yīng)的時間過程。之前已經(jīng)確定S100a10（p11蛋白）是一種受應(yīng)激影響的重要分子，對抗抑郁反應(yīng)至關(guān)重要。因此，研究者分析了S100a10調(diào)節(jié)對氟西汀治療的動態(tài)響應(yīng)。有趣的是，研究者發(fā)現(xiàn)S100a10的轉(zhuǎn)錄在時間上受到調(diào)控，僅在治療的后期即9到14天之間受到刺激，這與觀察到的行為改善的時間線更接近。因此，可以使用S100a10轉(zhuǎn)錄作為晚期反應(yīng)階段的代表，并通過控制S100a10的轉(zhuǎn)錄因子，來確定延遲反應(yīng)的原因。已知p11容易被生長因子誘導(dǎo)，因此，研究者應(yīng)用潛在的生長因子在小鼠原代混合皮層培養(yǎng)物中刺激S100a10轉(zhuǎn)錄，這是一種廣泛用于研究神經(jīng)元生理特性的模型系統(tǒng)。在受試因子中，研究者觀察到BDNF和FGF2（3倍）對S100a10轉(zhuǎn)錄的強烈快速誘導(dǎo)（刺激后2h內(nèi)），以及EGF（1.2倍）的小誘導(dǎo)。此前，已有研究人員報道過FGF2-和BDNF信號通路在情緒調(diào)節(jié)中的重要作用，以及它們提供抗抑郁藥物反應(yīng)的需求和充分性。此外，在MDD患者中觀察到這兩種因子水平降低的相關(guān)性，并在應(yīng)激和抑郁動物模型中觀察到它們的下調(diào)。因此，研究者的發(fā)現(xiàn)和文獻先例使研究者選擇FGF2、BDNF和S100a10表達作為時間標(biāo)記物來代表氟西汀反應(yīng)的時間過程。

血清素調(diào)節(jié)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中FGF2、BDNF和S100a10的表達
       為了定位哪一種膠質(zhì)和神經(jīng)細胞類型刺激了慢性血清素治療后的FGF2、BDNF和S100a10的表達，研究者使用ACD公司的RNAscope多重?zé)晒庠噭┖?/span>v2 ( Cat #。323100)進行RNAscope多重?zé)晒鈱嶒炦M行熒光原位雜交檢測(FISH)。為了在單細胞水平檢測單分子RNA靶標(biāo)，同時用FGF2、BDNF和S100a10 mRNA的RNA探針標(biāo)記混合培養(yǎng)，并將它們與細胞類型特異性RNA探針配對，以標(biāo)記神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的亞型。用Akoya Biosciences公司的Opal 520、570、620和690試劑盒，在40℃條件下進行1h的酪氨酸信號放大反應(yīng)，用共焦顯微鏡成像觀察。
       研究者發(fā)現(xiàn)，慢性血清素治療在第7天刺激了星形膠質(zhì)細胞中的FGF2 mRNA;在第10 ~ 14天神經(jīng)元BDNF mRNA表達和S100a10 mRNA表達有變化。值得注意的是，表達BDNF的神經(jīng)元與表達S100a10的神經(jīng)元不同。

FGF2和BDNF信號之間的神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)依賴的交叉交流
       為了了解神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞依賴的BDNF合成調(diào)控，研究者分析了混合培養(yǎng)和神經(jīng)元培養(yǎng)中FGF2和BDNF依賴的S100a10轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究者發(fā)現(xiàn)FGF2僅在混合培養(yǎng)中誘導(dǎo)S100a10的轉(zhuǎn)錄，而BDNF在混合培養(yǎng)和神經(jīng)元培養(yǎng)中均誘導(dǎo)S100a10的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果表明，上游FGF2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能與需要神經(jīng)膠質(zhì)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的BDNF合成有關(guān)。接下來，研究者分析了FGF2和BDNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的相互作用，并觀察到一種強烈的正向自動反饋調(diào)節(jié)。在混合培養(yǎng)和神經(jīng)元培養(yǎng)中，應(yīng)用FGF2可刺激FGF2 mRNA，而應(yīng)用BDNF可刺激BDNF mRNA。有趣的是,研究者觀察到一個強大的互惠交叉調(diào)節(jié), FGF2僅在混合培養(yǎng)中刺激BDNF mRNA，而在神經(jīng)元培養(yǎng)中沒有。這些結(jié)果表明，依賴于fgf2的S100a10表達的刺激是通過激活BDNF-TrkB信號，需要神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細胞的相互作用。因此，研究者抑制了TrkB受體的激活，并證明在混合培養(yǎng)中，S100a10轉(zhuǎn)錄的fgf2依賴刺激是通過激活TrkB信號來實現(xiàn)的。正如預(yù)期的那樣，在混合培養(yǎng)和神經(jīng)元培養(yǎng)中，抑制FGFR1受體(主要與FGF2結(jié)合)后，S100a10的FGF2刺激被下調(diào)，而抑制TrkB受體激活后，S100a10的BDNF刺激被下調(diào)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)GF2僅通過依賴神經(jīng)膠質(zhì)細胞的方式調(diào)控BDNF合成，以及隨后激活神經(jīng)元中的BDNF - trkb信號通路來刺激S100a10的表達。
       研究者的結(jié)果表明，關(guān)鍵情緒調(diào)節(jié)分子的刺激是在一個復(fù)雜的神經(jīng)膠質(zhì)細胞多細胞回路中進行時間調(diào)節(jié)的。
      
       研究者建立了一個復(fù)雜的神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞功能網(wǎng)絡(luò)開始慢性氟西汀/慢性血清素治療啟動反應(yīng)。這個網(wǎng)絡(luò)涉及到星形膠質(zhì)細胞中FGF2信號的順序激活，它直接以神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞依賴的方式調(diào)節(jié)BDNF的合成，隨后BDNF - trkb信號的激活促進了神經(jīng)元的適應(yīng)(通過S100a10等基因表達的改變)，這最終可能導(dǎo)致體內(nèi)情緒的改善。因此，這項研究確定了在理解抗抑郁藥延遲作用機制中所缺少的關(guān)鍵步驟。

      小結(jié)

      研究者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2和BDNF信號的神經(jīng)信號通路緊密控制著復(fù)雜的神經(jīng)膠質(zhì)細胞回路的功能，從而引發(fā)抗抑郁反應(yīng)。研究者推測，只有通過激活神經(jīng)信號通路，重新設(shè)置被破壞的神經(jīng)膠質(zhì)細胞回路，抗抑郁反應(yīng)才可能持續(xù)。研究者的體外模型系統(tǒng)為新型抗抑郁藥物的測試提供了一個可行的途徑。進一步刻畫神經(jīng)膠質(zhì)細胞在應(yīng)激和抗抑郁反應(yīng)中相互作用的關(guān)鍵作用，不僅將拓展研究人員對大腦穩(wěn)態(tài)和修復(fù)控制機制的理解，而且還揭示了復(fù)雜行為調(diào)控的關(guān)鍵特征。此項研究為應(yīng)激性抑郁的病理生理學(xué)和抗抑郁藥物的作用機制提供了更深入的見解。

參考文章：https://doi.org/10.1101/2021.07.23.453443