Nature子刊文獻(xiàn)解讀：癌癥通過CD73檢查點網(wǎng)絡(luò)來抑制免疫反應(yīng)

美國奧古斯塔大學(xué)的研究人員通過人類腫瘤組織和小鼠腫瘤模型上的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）是結(jié)直腸癌等腫瘤微環(huán)境中主要的CD73^hi群體。這項成果發(fā)表在《Nature Communications》雜志上，表明結(jié)直腸癌建立了一個交互式檢查點網(wǎng)絡(luò)，以阻止免疫系統(tǒng)攻擊。
 

研究背景
CD73是癌癥免疫治療的新興靶點之一。它是一種常見的免疫檢查點，可將激活免疫反應(yīng)的ATP轉(zhuǎn)化為抑制免疫反應(yīng)的腺苷（ADO），從而抑制免疫反應(yīng)。以往的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中的CD73水平升高與不良臨床結(jié)局有關(guān)。然而，腫瘤微環(huán)境中CD73活性的主要來源仍未明確，具體機(jī)制也不清楚。

CAF來源于正常的成纖維細(xì)胞，包括組織內(nèi)的成纖維細(xì)胞和骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）。CD73已經(jīng)被用作于MSC標(biāo)記物之一，故需檢測CD73在CAF上的表達(dá)，以及CAF-CD73在TME中是否有強(qiáng)制免疫檢查點通路。

研究材料
C57BL/6小鼠，CD73^null (B6.129S1-Nt5e^tm1Lft/J)小鼠，GFP-Tg (C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J)小鼠, A_2B^null (B6.129P2-Adora2b^tm1Till/J)小鼠，E.G7-OVA細(xì)胞，mc-38細(xì)胞，C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（購于賽業(yè)OriCell，貨號MUBMX-01001），人類大腸癌臨床標(biāo)本等。

研究路線
1.分析人結(jié)直腸癌（CRC）標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)CD73高表達(dá)是人類CRC-CAF的獨特特征。

2.對已發(fā)表的結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集進(jìn)行主成分分析，研究人類結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中的CD73高水平表達(dá)與CAF豐度、免疫抑制增強(qiáng)和預(yù)后不良之間的關(guān)系。

3.進(jìn)行雙向骨髓移植研究EG7腫瘤微環(huán)境中的CD73失活對腫瘤的影響。

4.通過在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)EG7-CAF和MSC，分析CAF-CD73上調(diào)的分子機(jī)制。

研究結(jié)果
CAF是CD73活性的主要來源
研究人員首先分析了多份人結(jié)直腸癌（CRC）標(biāo)本，以分析腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中的CD73表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)，CD73蛋白表達(dá)高度集中在成纖維細(xì)胞基質(zhì)或腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞上。多個數(shù)據(jù)集的比對分析表明，CD73高表達(dá)是人類CRC-CAF的獨特特征。

之后，他們對已發(fā)表的結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)CD73表達(dá)與CAF豐度之間存在正相關(guān)。重要的是，557名患者的NT5E（CD73編碼基因）高表達(dá)與較差的臨床結(jié)局相關(guān)。這些結(jié)果表明，人類結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中的CD73高水平表達(dá)與CAF豐度、免疫抑制增強(qiáng)和預(yù)后不良呈正相關(guān)（圖1）。
 

圖1. CD73高水平表達(dá)與CAF豐度和預(yù)后不良相關(guān)

他們接著使用了小鼠EG7 T淋巴瘤模型，發(fā)現(xiàn)EG7-CAF與人類CRC-CAF相似，代表了獨特的CD73^hi/+群體，在腫瘤微環(huán)境中形成廣泛網(wǎng)絡(luò)。接下來，研究人員又分析了CD73活性對腫瘤生長的影響。他們比較了Cd73^null和WT小鼠的EG7 T淋巴瘤進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)Cd73^null小鼠的腫瘤進(jìn)展受阻，而WT小鼠則進(jìn)展迅速。

為了驗證CAF-CD73的貢獻(xiàn)，他們后續(xù)開展了雙向的骨髓移植，將WT或Cd73^null小鼠的骨髓移植到致死劑量輻照的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠中，再將GFP轉(zhuǎn)基因小鼠或Cd73^null小鼠的骨髓移植到輻照的Cd73^null小鼠中，并在2個月后接種EG7腫瘤。值得注意的是，接受WT或Cd73^null骨髓的Cd73^null小鼠經(jīng)歷了腫瘤完全消退（圖2）。后續(xù)分析表明，Cd73^null CAF無法產(chǎn)生腺苷，就無法抑制T細(xì)胞的活化和增殖。因此，EG7腫瘤微環(huán)境中的CD73失活可導(dǎo)致抗腫瘤免疫增強(qiáng)和隨之而來的腫瘤消退。
 

圖2. CD73失活可導(dǎo)致腫瘤消退

CAF-CD73上調(diào)的機(jī)制分析
研究人員還分析了不同大小的EG7腫瘤，發(fā)現(xiàn)腫瘤越大，CAF越多，而CD73水平也隨之增加。為了闡明CAF-CD73上調(diào)的分子機(jī)制，他們首先在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)EG7-CAF和MSC，發(fā)現(xiàn)Nt5e mRNA和細(xì)胞表面CD73的表達(dá)均未升高。隨后在腺苷存在的情況下培養(yǎng)CAF，發(fā)現(xiàn)Nt5e的表達(dá)顯著提高。

不同亞型的腺苷受體是組成型的，但在不同組織中差異表達(dá)。RNA-seq分析結(jié)果表明，Adora2a (A_2a)和Adora2b (A_2b)是成纖維細(xì)胞基質(zhì)中表達(dá)的主要亞型。qRT-PCR分析則表明，T細(xì)胞主要表達(dá)A_2a，而CAF和MSC優(yōu)先表達(dá)A_2b。他們還發(fā)現(xiàn)，A_2B拮抗劑而不是A_2A拮抗劑能阻止腺苷誘導(dǎo)的CD73上調(diào)。實驗中使用的MSC由賽業(yè)OriCell^®提供。

研究人員發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤及其CAF的生長，腫瘤中會發(fā)生自然細(xì)胞死亡。高水平CD73很容易將垂死的腫瘤細(xì)胞釋放的ATP轉(zhuǎn)化為腺苷，而腺苷通過激活免疫細(xì)胞上表達(dá)的A_2A受體來抑制免疫反應(yīng)。與此同時，腺苷還激活了另一種CAF上表達(dá)的受體A_2B，并促使CAF產(chǎn)生更多的CD73。他們認(rèn)為，盡管A_2A和A_2B都是腺苷受體，但它們并不是冗余的，因為它們在抑制免疫反應(yīng)方面的作用不同。

進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，在EG7荷瘤小鼠中，A_2A拮抗劑ZM241385、A_2B拮抗劑PSB1115和CD73中和抗體的結(jié)合使用顯著抑制了腫瘤進(jìn)展，導(dǎo)致一些小鼠中的腫瘤完全消退（圖3）。這表明，阻斷腫瘤微環(huán)境中A_2A、A_2B和CD73的非冗余功能可最大程度逆轉(zhuǎn)免疫抑制。
 

圖3. CD73中和結(jié)合A_2A和A_2B拮抗劑可導(dǎo)致腫瘤消退

總結(jié)
總的來說，這項研究揭示了CAF的一種之前未發(fā)現(xiàn)的免疫抑制功能。這種CAF-CD73^hi狀態(tài)在腫瘤進(jìn)展和治療過程中被動態(tài)調(diào)控和加強(qiáng)。研究人員認(rèn)為，從治療的角度來看，應(yīng)考慮同時阻斷CAF-A_2B-CD73回路和ADO-A_2A依賴的免疫抑制，從而實現(xiàn)持久的腫瘤控制。

原文檢索
Yu, M., Guo, G., Huang, L. et al. CD73 on cancer-associated fibroblasts enhanced by the A2B-mediated feedforward circuit enforces an immune checkpoint. Nat Commun 11, 515 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-019-14060-x

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