多光譜光聲斷層掃描紅外二區(qū)熒光成像診斷間質(zhì)性膀胱炎和肝臟缺血實(shí)驗(yàn)

本文要點(diǎn)：苯并噻二唑核發(fā)色團(tuán)具有良好的穩(wěn)定性、較大的斯托克偏移和易于擴(kuò)展發(fā)射到NIR-II范圍等優(yōu)點(diǎn)。然而，在充分發(fā)揮其生物應(yīng)用潛力之前，還需要克服水溶性差、水溶液中的聚集致猝滅ACQ和非活化反應(yīng)等障礙，這些熒光團(tuán)通常是惰性探針，發(fā)出不變的或“一直開著”的信號(hào)，構(gòu)成附加的背景噪音，不能對(duì)特定刺激做出反應(yīng)，無法實(shí)現(xiàn)生物標(biāo)志物激活的檢測或成像。在本研究中，作者設(shè)計(jì)了一種可激活的苯并噻二唑核納米探針BTPE-NO2@F127,此探針具有AIE特性，通過整合生物標(biāo)記物響應(yīng)部分和采用封裝分子探針的自組裝設(shè)計(jì)策略克服上述障礙，該納米探針用于體內(nèi)NIR-II熒光成像和MSOT成像能夠原位響應(yīng)曲唑酮誘導(dǎo)的肝損傷，肝缺血再灌注損傷（I/R）和間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型中的H2O2生物標(biāo)志物進(jìn)而進(jìn)行檢測和成像，此外，獲得的三維MSOT圖像有利于三維信息的疾病部位可視化。

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納米探針BTPE-NO2@F127的合成策略如圖1所示，將苯并噻二唑核與兩個(gè)四苯基作為疏水分子轉(zhuǎn)子連接，然后在核兩端加入兩個(gè)硝基苯氧乙酰胺單元作為識(shí)別基團(tuán)和熒光猝滅劑。然后使用經(jīng)FDA批準(zhǔn)的兩親性聚合物Pluronic F127來封裝BTPE-NO2分子，以生成納米探針BTPE-NO2@F127。

圖1：納米探針BTPE-NO2@F127的制備及其應(yīng)用（間質(zhì)性膀胱炎、曲唑酮誘導(dǎo)的肝損傷和小鼠肝臟I/R損傷）示意圖。

 

隨后，作者對(duì)合成的納米探針進(jìn)行表征如圖2所示，為了驗(yàn)證BTPE-NH2的AIE特性，測量了其在二甲基亞砜(DMSO)/水(好溶劑:DMSO，差溶劑:水)的混合物中隨水餾分變化的熒光強(qiáng)度。改變水餾分可以微調(diào)溶劑混合物的溶解能力，相應(yīng)地調(diào)整BTPE - NH2的聚集程度。如圖2a、b所示，隨著水餾分的增加，BTPE- NH2溶液的發(fā)射強(qiáng)度明顯增加，表現(xiàn)出典型的AIE特征。當(dāng)水含量達(dá)到99%時(shí)，BTPE-NH2的熒光強(qiáng)度比DMSO溶液增強(qiáng)12.8倍。由于探針BTPE-NO2具有較強(qiáng)的疏水性和較高的共軛性，經(jīng)Pluronic F127封裝后可獲得較高的封裝效率(98%)，BTPE-NO2在納米探針BTPE-NO2@F127中的負(fù)載能力為9.3%。透射電子顯微鏡(TEM)顯示納米探針BTPE-NO2@F127具有相對(duì)均勻的球形形貌，直徑約為37 nm(圖2c)，動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測量的納米探針BTPE-NO2@F127的粒徑分布如圖2c所示。在37℃下在PBS (10 mM, pH=7.4)中測量不同濃度的H2O2處理BTPE-NO2@F127后的光譜(圖2d-g)。1028 nm處的熒光強(qiáng)度隨著H2O2濃度的增加而增加(圖2d-g)，而納米探針BTPE-NO2@F127在沒有H2O2的情況下發(fā)射微弱。納米探針BTPENO2@F127在H2O2孵育前后的吸收光譜如圖2f所示。在對(duì)H2O2反應(yīng)之前，該納米探針BTPENO2@F127在615 nm處表現(xiàn)出最大的吸收。對(duì)H2O2反應(yīng)后，最大吸收紅移至約680 nm，吸收帶范圍為600 ~ 850 nm。從圖2f, g中可以明顯看出，隨著H2O2濃度的增加，吸收光譜發(fā)生紅移，680 ~ 850 nm處的吸光度明顯增加。這些數(shù)據(jù)清楚地表明，熒光強(qiáng)度的增加是由于探針對(duì)H2O2的響應(yīng)。BTPE-NO2@F127納米探針在680-900 nm范圍內(nèi)與不同濃度的H2O2孵育后的光聲強(qiáng)度見圖2h。光聲強(qiáng)度與H2O2濃度(0 ~ 100μm)呈明顯的線性關(guān)系(圖2h)。此外，在808 nm激光連續(xù)照射60分鐘(圖2i)下，納米探針BTPE-NO2@F127與H2O2和其可激活形式BTPE - NH2相比，具有更好的光穩(wěn)定性。

圖2：納米探針的表征。(a) BTPE-NH2在DMSO/H2O混合物中與不同水組分的NIR-II熒光光譜。(b) BTPE- NH2的熒光強(qiáng)度與水餾分的關(guān)系圖。(c)納米探針的DLS和TEM圖像。(d)BTPE-NO2@F127與不同濃度H2O2孵育90分鐘后的NIR-II熒光光譜。(e)納米探針在不同濃度的H2O2處理后在1028nm處的熒光強(qiáng)度。(f )BTPE-NO2@F127在不同濃度的H2O2中的吸收光譜。(g)納米探針BTPE-NO2@F127在不同H2O2水平下的吸光度。(h)納米探針與不同濃度的H2O2孵育后的相對(duì)光聲強(qiáng)度(i)BTPE-NH2、BTPE - NO2與H2O2、ICG共孵育的光穩(wěn)定性。

 

基于上述令人鼓舞的結(jié)果，證實(shí)了納米探針BTPE-NO2@F127可以有效地響應(yīng)H2O2，從而產(chǎn)生NIR-II熒光和光聲信號(hào)，作者將該納米探針應(yīng)用于幾種炎癥疾病的診斷。圖3和圖4顯示了利用BTPENO2@F127探針對(duì)間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型進(jìn)行成像。間質(zhì)性膀胱炎是一種以盆腔疼痛、尿頻尿急為特征的膀胱炎癥性疾病。這種疾病很難診斷，因?yàn)槟壳斑�沒有專門的臨床試驗(yàn)來診斷這種疾病。間質(zhì)性膀胱炎患者膀胱內(nèi)活性氧(包括H2O2)的生成增強(qiáng)，因此H2O2可作為該疾病的原位生物標(biāo)志物。因此，作者可以使用納米探針BTPE-NO2@F127通過響應(yīng)原位生物標(biāo)志物H2O2來診斷間質(zhì)性膀胱炎。環(huán)磷酰胺(CYP，商品名Cytoxan或Neosar)是一種FDA批準(zhǔn)的化療藥物，誘導(dǎo)間質(zhì)性膀胱炎是其眾所周知的不良反應(yīng)之一。因此，我們通過腹腔注射不同劑量的CYP建立間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型。如圖3a所示，當(dāng)雌性小鼠腹腔注射CYP 24小時(shí)后，將納米探針BTPE-NO2@F127注射到小鼠體內(nèi)，然后進(jìn)行NIR-II熒光成像和MSOT成像。從NIR-II熒光成像結(jié)果(圖3b)可以看出，熒光強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸增加，在注射BTPENO2@F127后約90min達(dá)到最大，然后由于代謝作用逐漸減弱。膀胱內(nèi)過表達(dá)的H2O2激活納米探針，發(fā)出NIR-II熒光信號(hào)。在BTPE-NO2@F127注射90 min后，高劑量CYP組(150 mg/kg)比低劑量CYP組(75 mg/kg)和正常對(duì)照組(健康小鼠)表現(xiàn)出更高的熒光強(qiáng)度，提示高劑量CYP對(duì)膀胱區(qū)域造成更嚴(yán)重的損傷。

圖3：納米探針BTPE-NO2@F127通過NIR-II熒光成像在間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型中的應(yīng)用。(a)間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型建立及成像實(shí)驗(yàn)示意圖。(b)在BTPE-NO2@F127注射后不同時(shí)間點(diǎn)NIR-II成像。

 

用BTPENO2@F127探針對(duì)間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型進(jìn)行MOST成像（圖4a）,對(duì)對(duì)照組和間質(zhì)性膀胱炎模型小鼠的膀胱組織進(jìn)行組織學(xué)分析(H&E染色)(圖4b)�？梢郧宄�的看到，在CYP治療的模型組中，可以觀察到出血、水腫和尿路上皮脫落，且CYP劑量越大，情況越嚴(yán)重。這些結(jié)果證實(shí)了納米探針BTPENO2@F127可以通過響應(yīng)原位生物標(biāo)志物H2O2來檢測膀胱炎癥，從而通過NIR-II熒光和MSOT成像對(duì)間質(zhì)性膀胱炎進(jìn)行無創(chuàng)診斷。

圖4：納米探針BTPE-NO2@F127在間質(zhì)性膀胱炎小鼠模型中的MSOT成像應(yīng)用(a)和H&E分析(b)

 

用BTPE-NO2@F127探針對(duì)肝損傷小鼠模型成像結(jié)果如圖5所示。曲唑酮是臨床用于治療抑郁癥的藥物，日劑量過大會(huì)引起肝損傷。眾所周知，在肝損傷時(shí)，ROS在肝區(qū)過表達(dá)，因此肝臟H2O2可作為肝損傷或損傷的內(nèi)源性生物標(biāo)志物。用曲唑酮(其結(jié)構(gòu)如圖5a所示)連續(xù)3天腹腔注射不同劑量的曲唑酮刺激雄性小鼠肝損傷。最后一次注射曲唑酮后6 h(第三天)，采用Elisa試劑盒檢測各組血清ALT水平。觀察到小鼠血清ALT水平隨曲唑酮?jiǎng)┝康脑黾佣�升�?圖5b)，證實(shí)了肝損傷的嚴(yán)重程度隨曲唑酮?jiǎng)┝康脑黾佣�增加。接下來，我們使用納米探針BTPE-NO2@F127來成像肝臟損傷。圖5c顯示了對(duì)照組和給予不同劑量曲唑酮組小鼠靜脈注射BTPE-NO2@F127后0分鐘和120分鐘時(shí)的NIR-II熒光圖像。曲唑酮組小鼠在注射納米探針BTPE-NO2@F127前0 min無熒光，注射納米探針BTPENO2@F127后120 min，熒光強(qiáng)度隨曲唑酮?jiǎng)┝康脑黾佣�增加。圖5d給出了肝臟區(qū)域感興趣區(qū)域(ROI)的量化強(qiáng)度(圖5c)，為熒光圖像提供了直觀的數(shù)據(jù)。納米探針BTPE-NO2@F127作用120min后，不同組小鼠切除器官(腎、心、肝、肺和脾)的熒光強(qiáng)度如圖5e所示，這些器官的NIR-II熒光圖像如圖5f所示。肝臟的熒光明顯強(qiáng)于心、脾、肺、腎等其他主要器官，不同劑量曲唑酮處理組的熒光強(qiáng)度呈劑量依賴性。圖5g為不同組小鼠肝臟區(qū)域的三維正交視圖MSOT圖像，能夠反映不同組小鼠肝臟損傷的三維信息�？梢�，未注射曲唑酮的小鼠在注射納米探針后，肝臟區(qū)域出現(xiàn)微弱的MSOT信號(hào)，這是由于健康小鼠肝臟區(qū)域存在較低的ROS(包括H2O2)水平。實(shí)驗(yàn)組接受不同數(shù)量的曲唑酮(50,100或200mg/kg)治療,在他們的肝臟區(qū)域發(fā)現(xiàn)顯著MSOT信號(hào), 高劑量曲唑酮治療組小鼠的信號(hào)更強(qiáng),表明高曲唑酮?jiǎng)┝康男∈笤馐芨鼑?yán)重的肝損傷。這些結(jié)果表明，MSOT成像可以在時(shí)空上檢測肝損傷引起的肝區(qū)H2O2水平的升高。隨后，分別對(duì)給予0、50、100和200 mg /kg 曲唑酮預(yù)處理的小鼠實(shí)施安樂死，獲得其肝臟組織，對(duì)不同組小鼠肝臟組織切片進(jìn)行組織學(xué)分析(H&E染色)(圖5h)。對(duì)照組肝組織切片顯示形態(tài)正常，無明顯畸變，而曲唑酮組肝組織切片顯示核胞漿分離、空泡化和水變性，這表明高劑量曲唑酮可加重肝損傷的嚴(yán)重程度。
 

圖5：納米探針BTPE-NO2@F127在曲唑酮肝損傷小鼠模型中的應(yīng)用。(a)曲唑酮的分子結(jié)構(gòu)。(b)各組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平。(c)鹵素?zé)?作為亮場圖像)和NIR-II熒光圖像。(d )c組小鼠肝臟部位ROI處平均NIR-II熒光強(qiáng)度。(e) f對(duì)應(yīng)NIR-II熒光圖像的主要器官NIR-II熒光強(qiáng)度均值。(f)不同組在靜脈注射BTPE-NO2@F127后120分鐘內(nèi)解剖器官(心、肝、脾、肺、腎)的代表性離體NIR-II熒光圖像。(g) BTPE-NO2@F127注射后120分鐘小鼠的典型3D MSOT圖像。(h)各組肝切片H&E染色

 

此外，作者使用納米探針來成像肝缺血再灌注損傷(I/R)。肝缺血再灌注損傷(I/R)是臨床各種情況下的主要并發(fā)癥，如肝切除術(shù)、肝移植、失血性休克、復(fù)蘇和創(chuàng)傷手術(shù)等，也是肝移植排斥反應(yīng)導(dǎo)致死亡的主要原因。在肝I/R損傷的情況下，ROS(包括H2O2)在肝區(qū)過表達(dá)，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重肝損傷。在這里，作者利用納米探針BTPENO2@F127檢測其對(duì)肝臟H2O2響應(yīng)的肝損傷程度。小鼠分別缺血0 min(假手術(shù)組為對(duì)照組)、30 min或60 min，然后再灌注24 h。圖6a為小鼠肝臟I/R過程。在缺血的情況下，肝臟因供血受阻而呈蒼白色，取下血管鉗，可見血流灌注明顯。將納米探針BTPE-NO2@F127靜脈注射到假手術(shù)組和I/R模型組小鼠，分別進(jìn)行MSOT成像和NIR-II熒光成像。老鼠的肝臟區(qū)域的NIR-II熒光圖像和熒光強(qiáng)度顯示在圖6 b, c。假手術(shù)組小鼠的肝臟區(qū)域顯示微弱熒光，I/R模型組在注射納米探針BTPE-NO2@F127后90分鐘或120分鐘時(shí)肝臟的缺血區(qū)域顯示明顯的熒光。長時(shí)間缺血組(缺血60min)比短時(shí)間缺血組(缺血30min)熒光強(qiáng)度更高，這是因?yàn)殚L時(shí)間缺血組肝臟產(chǎn)生的H2O2更多，缺血時(shí)間更長，相應(yīng)的肝臟損傷更嚴(yán)重。在I/R過程中缺血30min或60min組(圖6d)，肝臟主要器官之間的熒光更強(qiáng)，這與體內(nèi)成像結(jié)果一致。

圖6：納米探針BTPE-NO2@F127通過NIR-II熒光成像在肝臟缺血-再灌注損傷小鼠模型中的應(yīng)用。(a) I/R過程手術(shù)照片(b)假手術(shù)組(缺血0分鐘)和I/R模型小鼠(缺血30分鐘或60分鐘后再灌注24小時(shí))靜脈注射BTPE-NO2@F127納米探針后不同時(shí)間點(diǎn)的NIR-II熒光圖像。(c) b對(duì)應(yīng)ROI(藍(lán)圈)的肝臟區(qū)域的平均NIR-II熒光強(qiáng)度。(d)不同小鼠組在靜脈注射BTPENO2@F127納米探針120 min后解剖主要器官(腎、肺、脾、心、肝)的代表性離體NIR-II圖像。I缺血，R再灌注。

 

然后，利用納米探針BTPE-NO2@F127進(jìn)行MSOT成像檢測肝臟I/R損傷。相關(guān)數(shù)據(jù)如圖7a所示。圖7a為不同組小鼠靜脈注射BTPE-NO2@F127后不同時(shí)間點(diǎn)的MSOT橫切面圖像。肝臟區(qū)域ROI MSOT強(qiáng)度的量化數(shù)據(jù)見圖7b。作為器官位置的參考，雄性小鼠對(duì)應(yīng)于小鼠肝臟區(qū)域的冷凍切片圖像如圖7c所示。對(duì)照組(假手術(shù)組)在靜脈注射BTPE-NO2@F127納米探針后120 min肝區(qū)未出現(xiàn)明顯的MSOT信號(hào)(圖7a、b)，而缺血組小鼠在120 min時(shí)出現(xiàn)明顯的MSOT信號(hào)，提示肝損傷的形成。長缺血組(缺血60min)肝區(qū)信號(hào)較對(duì)照組(缺血0min)和短缺血組(缺血30min)明顯。為了驗(yàn)證I/R過程與肝損傷的關(guān)系，我們用Elisa試劑盒測定了血清中ALT和AST的酶活性。I/R過程導(dǎo)致這些血清酶活性顯著增強(qiáng)(圖7d)，證明肝功能障礙與I/R過程確實(shí)存在直接相關(guān)性，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相似。圖7e為I/R過程不同組小鼠(sham組、shore缺血組、long缺血組)靜脈注射納米探針BTPENO2@F127后120 min的3D MSOT圖像。接受I / R組長時(shí)間缺血(60分鐘),受傷的肝臟可以明顯觀察到MSOT信號(hào)很強(qiáng),這是由于長時(shí)間缺血受傷的肝臟的體積(大小)大于短時(shí)間缺血(30分鐘)的肝損傷體積。然后，對(duì)安樂死后不同組小鼠解剖器官進(jìn)行MSOT成像(附圖41、42)。缺血30、60 min的I/R組肝臟MSOT信號(hào)明顯高于其他器官，驗(yàn)證了體內(nèi)成像觀察結(jié)果。并對(duì)不同組小鼠的肝臟進(jìn)行切片組織學(xué)分析(圖7f)。與假手術(shù)組相比，長缺血組(60 min)和短缺血組(30 min)炎癥細(xì)胞浸潤和空泡變性明顯，且長缺血組較短缺血組更為嚴(yán)重。提示I/R過程小鼠肝損傷嚴(yán)重。

圖7：納米探針BTPE-NO2@F127在MSOT成像小鼠肝臟缺血-再灌注損傷模型中的應(yīng)用。

(a)不同組在靜脈注射納米探針BTPE-NO2@F127后0min和120min MSOT圖像(I缺血，R再灌注)。器官標(biāo)記:“1”代表脊髓。(b) a.對(duì)應(yīng)ROI(白色虛線)的平均MSOT強(qiáng)度。(c)雄性小鼠冷凍切片圖像(d)各組小鼠血清ALT、AST兩種酶水平。(e)BTPE-NO2@F127納米探針注射后120分鐘，不同組的典型3D MSOT圖像。“1”代表脊髓。(f)各組小鼠肝臟切片代表性H&E染色I(xiàn)缺血，R再灌注，MSOT多光譜光聲斷層掃描。

 

參考文獻(xiàn)

Chen Junjie, etal."A H2O2-activatable nanoprobe for diagnosing interstitialcystitis and liver ischemia-reperfusion injury via multispectral optoacoustictomography and NIR-II fluorescent imaging." NatureCommunications 12.1(2021): doi:10.1038/S41467-021-27233-4.

 

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