ZenoTOF 7600系統(tǒng)應(yīng)用：生物制藥抗體從頭測(cè)序

2021年，我國(guó)生物制品研制與生產(chǎn)取得多項(xiàng)重要突破。生物大分子藥物熱度持續(xù)增高，重組蛋白藥物、血液制品新增上市產(chǎn)品數(shù)量是2020年的6倍；細(xì)胞和基因治療藥物新增上市2款CAR-T產(chǎn)品，較2020年實(shí)現(xiàn)了零突破；全球首款吸入式疫苗研發(fā)取得突破。資本市場(chǎng)對(duì)生物藥領(lǐng)域持續(xù)加碼，投融資金額較2020年增長(zhǎng)1.6倍，顯示我國(guó)生物藥領(lǐng)域擁有巨大創(chuàng)新活力和增長(zhǎng)潛力^[1].
                                                                 
抗體從頭測(cè)序在生物制藥行業(yè)中是非常重要的手段，在發(fā)現(xiàn)新的候選抗體藥物、鑒定用于研究的試劑以及生物仿制藥開(kāi)發(fā)中創(chuàng)新產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)確定等方面具有重要應(yīng)用。目前有多種算法和軟件可以根據(jù)肽段母離子質(zhì)量和二級(jí)碎片信息進(jìn)行從頭測(cè)序，此外，通過(guò)搜庫(kù)的方法也可以獲得更完整的信息。但是對(duì)于抗體而言，肽段從頭測(cè)序和搜庫(kù)策略都具有很大的挑戰(zhàn)，因?yàn)榭贵w序列會(huì)針對(duì)特定抗原進(jìn)行微調(diào)，每個(gè)免疫反應(yīng)都會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的抗體序列，人類(lèi)中獨(dú)特抗體序列的數(shù)量預(yù)計(jì)約 100 億之多^[2]，這對(duì)于從頭測(cè)序或者蛋白質(zhì)搜庫(kù)來(lái)說(shuō)是不可想象的。
       
曲妥珠單抗，作為抗Her 2的單克隆抗體，是第一個(gè)用于治療實(shí)體瘤的人源化單克隆抗體，第一個(gè)被批準(zhǔn)的酪氨酸激酶抑制劑，也是第一個(gè)成功以生物標(biāo)志物為引導(dǎo)的抗癌癥藥物。它通過(guò)將自身附著在Her 2上來(lái)阻止人體表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在Her 2上的附著，從而阻斷癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
 
                                                                   
曲妥珠單抗樣品分別經(jīng)過(guò)Trypsin、GluC、Chymotrypsin、Pepsin和LysC五種酶酶解后得到的肽段樣品，在ZenoTOF™ 7600系統(tǒng)中進(jìn)行CID和EAD數(shù)據(jù)采集，將數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Protein Metrics軟件中，在De Novo sequencing模塊中進(jìn)行分析。Protein Metrics軟件可以對(duì)曲妥珠單抗的重鏈和輕鏈序列進(jìn)行正確的解析，序列覆蓋度達(dá)到100%（圖1）。圖2展示了輕鏈 V 區(qū)的序列覆蓋度，可以看到所有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）均能很好地被鑒定到。氨基酸序列中綠色序列代表根據(jù)二級(jí)離子信息得到的高可信度序列，黃色突出顯示部分代表中可信度序列。 此外，可變翻譯后修飾位點(diǎn)在圖中進(jìn)行了標(biāo)注，可進(jìn)一步在軟件中查看。
       
ZenoTOF™ 7600系統(tǒng)搭載了Zeno TRAP模塊，大幅提高離子占空比，有助于提升二級(jí)譜圖質(zhì)量。無(wú)論在CID模式（圖3）還是EAD模式（圖4）下，7600系統(tǒng)都可以得到質(zhì)量很高的二級(jí)譜圖，BY離子或CZ離子的覆蓋度都很高，這對(duì)于從頭測(cè)序的分析來(lái)說(shuō)具有重要意義。
         
   
在ZenoTOF™ 7600系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)EAD碎裂，因此可以對(duì)在CID模式下完全無(wú)法區(qū)分的同分異構(gòu)體亮氨酸和異亮氨酸進(jìn)行很好的鑒別，從而得到準(zhǔn)確的抗體序列。亮氨酸在EAD模式下可產(chǎn)生z-43的特征性離子，異亮氨酸產(chǎn)生z-29的特征性離子，根據(jù)特征性離子的不同可對(duì)二者進(jìn)行區(qū)分。圖5中展示了在EAD碎裂模式下，含有亮氨酸的序列中產(chǎn)生z-43離子，據(jù)此確定序列中氨基酸為亮氨酸，并且此肽段中包含三個(gè)亮氨酸，所有亮氨酸均可由二級(jí)譜圖中的z-29特征離子加以確認(rèn)。
   
                                                                 
 
   
利用ZenoTOF™ 7600系統(tǒng)產(chǎn)出的CID和EAD數(shù)據(jù)，結(jié)合Protein Metrics軟件的De Novo sequencing功能，我們建立了高效的抗體從頭測(cè)序流程，適用于高通量的分析，并且使用EAD數(shù)據(jù)可以很好地區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸，從而得到準(zhǔn)確可信的序列信息。


【1】2021生物藥領(lǐng)域發(fā)展回顧，火石創(chuàng)造
【2】Frank, A., Pevzner, P.: PepNovo: de novo peptide sequencing via probabilistic network modeling. Anal. Chem. 77, 964–973 (2005)