光學(xué)顯微解決方案在生物相分離研究中的應(yīng)用

原創(chuàng) OLYMPUS生命科學(xué) 
   
當(dāng) David Courson 和 Lindsay Moore 到達美國馬薩諸塞州伍茲霍爾實驗室時，他們的期待僅僅是通過這次暑期科研項目的機會，學(xué)習(xí)使用高端顯微鏡等新技術(shù)。作為研究生，他們從未想過這次旅程竟然幫助解決一個困擾生物學(xué)家長達25 年的難題。

導(dǎo)師交給他們的任務(wù)是觀察線蟲卵中RNA和蛋白分子構(gòu)成的小球（P顆粒）是如何形成的。這些結(jié)構(gòu)多變的小球的構(gòu)成一直困擾著生物學(xué)家，然而在顯微鏡下，Courson、Moore和他們的導(dǎo)師發(fā)現(xiàn)了一個非同尋常的現(xiàn)象：P顆粒像熔巖燈里的液滴一樣相互碰撞、融合。
 
和固相物質(zhì)不同，這是液體之間才有的現(xiàn)象。他們突然意識到，P顆粒并非固體核心，而像油醋調(diào)味瓶里的液滴，劇烈搖晃之后分散成很小的液滴，又很快地融合成大液滴。

他們的導(dǎo)師Anthony A. Hyman和他的博后Cliff Brangwynne回到德國馬克斯·普朗克分子細胞生物學(xué)和遺傳學(xué)研究所（MPI-CBG）后，開展了進一步的實驗。他們將充滿P顆粒的線蟲性腺放置在兩片薄玻璃中間，隨后迅速將兩片玻璃平行移動。在切力作用下，固體成分被涂抹開，但P顆粒相互融合、散落，正如傘上的雨滴。

這表明：通過“相分離”，可以讓細胞內(nèi)的特定分子聚集起來，從而在“混亂的”細胞內(nèi)部形成一定“秩序”。這項研究被發(fā)表在2009年6月的Science雜志上，并開始了生物相變/相分離研究的新篇章。
 
近年來大量的生物相變/相分離研究相繼涌現(xiàn)，相關(guān)的研究文章、綜述在各大期刊上呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，成為了細胞生物學(xué)研究的一大熱點。
 
生物相變/相分離事件在全球科研團隊的研究中被證實至少有如下七類生物學(xué)作用。

生物感知：感應(yīng)環(huán)境的微小變化，觸發(fā)相分離過程的速率比轉(zhuǎn)錄翻譯更快

觸發(fā)反應(yīng)：增加局部的分子濃度從而觸發(fā)生化反應(yīng)

抑制反應(yīng)：通過局部分子隔離從而抑制生化反應(yīng)

緩沖：形成局部的分子池，可在需要增加分子濃度時對外輸送，或在外界分子濃度飽和時進行回收存儲

分子定位：由于相分離過程本身具有選擇性，可讓特定分子在本地留存

做功：某些液滴具有粘彈性的特點，因此凝聚過程可以對外提供能量并做功

過濾：液滴中的分子疏松交聯(lián)產(chǎn)生的孔狀結(jié)構(gòu)甚至可以作為生物分子的過濾器。這在核孔中已經(jīng)得到了證實。
 
經(jīng)典的生物相分離研究通常包括以下的研究步驟： 


在相分離研究中，第一步往往是確定細胞內(nèi)某現(xiàn)象有相分離事件的參與。在該步驟中，研究人員在收集細胞內(nèi)相分離液滴后，通過使用物理方法（如降溫、添加PEG孵育等）在光學(xué)顯微鏡下觀察凝聚液滴的外觀形態(tài)、融合過程。為了證明液滴與周遭環(huán)境的物質(zhì)交換，活細胞熒光漂白后恢復(fù)（FRAP）觀察是一個必要的驗證方法。

研究的第二步往往根據(jù)課題的目的展現(xiàn)出研究方法的多樣性，常見的思路包括：相分離事件對細胞的影響或者重現(xiàn)致病過程等。在此步驟中，除了對液滴本身的精細觀察，還需要以更高的空間分辨率、時間分辨率的手段觀察細胞或更大的生物組織結(jié)構(gòu)變化。

研究的第三步常涉及到相分離事件的調(diào)控機制、關(guān)鍵分子的確定等開展更深入的研究，并能較明確地給出研究的生物學(xué)意義。常見的研究思路包括信號通路研究、大通量蛋白圖譜和蛋白組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究等。
 
       熒光漂白后恢復(fù)（FRAP）實驗可觀測液滴與周邊環(huán)境存在動態(tài)交互過程，因此常見用于從側(cè)面確認相分離現(xiàn)象的發(fā)生。另外，在液滴內(nèi)部、液滴外部環(huán)境、液滴的邊界進行FRAP實驗可以獲得大量動力學(xué)屬性數(shù)據(jù)（如分解速率、融合速率等）。

OLYMPUS全電動倒置顯微鏡 IXplore Pro 配合高精度光刺激模塊 cellFRAP 適合進行生物相分離實驗的第一步——提供全倍率下優(yōu)質(zhì)的熒光和DIC成像效果，而cellFRAP實時同步光操控模塊擁有獨立的高精度掃描振鏡，可在顯微鏡成像過程中獨立對精細區(qū)域進行光刺激。
       進一步的生物相分離研究需要觀察活體/細胞內(nèi)的現(xiàn)象，因此需要更高的時空分辨率。OLYMPUS激光掃描共聚焦顯微鏡FV3000是一套集高靈敏度、高分辨率和操作簡便于一體的共聚焦系統(tǒng)，非常適合進行FRAP實驗。特別是搭載了獨有的龍卷風(fēng)光刺激功能，可對目標(biāo)進行更精準(zhǔn)、更高效的光漂白。
 

        如果液滴運動較快，IXplore SpinSR轉(zhuǎn)盤共聚焦 與 cellFRAP 的組合則是更佳的選擇。該系統(tǒng)提供極快的成像速度、高達110nm分辨率，同時完全兼容Click and Bleach 模式，即使時刻處于移動中的液滴也可以被精準(zhǔn)地漂白。
 
配合高速Z-Stack拍攝，還可以極大緩解由于液滴在Z方向運動導(dǎo)致的亮度降低，最終獲得平滑的熒光漂白后恢復(fù)亮度曲線。
 

        如果想要觀察的目標(biāo)/液滴位于細胞膜，IXplore TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡將是首選。IXplore TIRF 比共聚焦系統(tǒng)更出色的Z軸分辨率，軸向分辨率可控制在50-200nm內(nèi)，非常適合對活細胞進行細胞膜的觀察。儀器完全兼容Click and Bleach模式，從而對細胞膜上快速移動的目標(biāo)進行精準(zhǔn)的漂白。
為更好地讓您了解相分離的應(yīng)用實例，我們特別邀請了上海交通大學(xué) 管彬 博士，以線上報告的形式分享他以第一作者在Science Bulletin上發(fā)表的研究工作，揭示相分離參與調(diào)控細胞自噬的分子機制。

報告題目：Arabidopsis AUTOPHAGY-RELATED3 (ATG3) facilitates the liquid–liquid phase separation of ATG8e to promote autophagy.
報告時間：2022年3月10日15:10-15:55
報告嘉賓：管彬 博士
上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，薛紅衛(wèi)教授課題組，博士后研究員
畢業(yè)于中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，主要從事磷脂分子和細胞自噬方向的研究。
近年來以第一作者在Science Bulletin，F(xiàn)rontiers in Plant Science發(fā)表研究論文，分別揭示相分離參與調(diào)控細胞自噬的分子機制，和淹水脅迫下細胞自噬與程序性細胞死亡的關(guān)系。
另外，博士期間研究的磷脂分子參與調(diào)控細胞自噬的分子機制的研究論文即將發(fā)表。 這個報告只是OBIC（Olympus Bio-Imaging Conference）中的一個亮點。
為期三天的研討會，Olympus邀請了來自世界不同地區(qū)多個領(lǐng)域頂尖專家，將于2022年3月9日-11日，以線上論壇形式，共同探索光學(xué)顯微鏡及生物成像技術(shù)的新維度（點擊了解OBIC）。
 

參考文獻：
Dolgin, Elie. “What Lava Lamps and Vinaigrette Can Teach Us about Cell Biology.” Nature, vol. 555, no. 7696, 2018, pp. 300–302.
Dolgin, Elie. “What lava lamps and vinaigrette can teach us about cell biology.” Nature vol. 555,7696 (2018): 300-302. doi:10.1038/d41586-018-03070-2
Nott, Timothy J et al. “Phase transition of a disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless organelles.” Molecular cell vol. 57,5 (2015): 936-947. doi:10.1016/j.molcel.2015.01.013
Alberti, Simon et al. “Considerations and Challenges in Studying Liquid-Liquid Phase Separation and Biomolecular Condensates.” Cell vol. 176,3 (2019): 419-434. doi:10.1016/j.cell.2018.12.035
Zhang, Hong et al. “Liquid-liquid phase separation in biology: mechanisms, physiological functions and human diseases.” Science China. Life sciences vol. 63,7 (2020): 953-985. doi:10.1007/s11427-020-1702-x