應(yīng)用：動態(tài)調(diào)節(jié)AIE分子非輻射和輻射衰減以實現(xiàn)光熱治療和免疫治療

本文要點：作者通過設(shè)計CAT-NP納米顆粒，利用其對氧化還原敏感型，使之在腫瘤細(xì)胞內(nèi)逐漸解體，實現(xiàn)對AIE分子輻射衰減與非輻射衰減的動態(tài)調(diào)控，從而達(dá)到成像和NIR-Ⅱ介導(dǎo)的光熱治療與免疫治療目的。
 

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光熱療法(photoactivated photothermal therapy，PTT)已被證實是一種安全的腫瘤消融模型。常見的光熱劑（如ICG、IR780）因為具有聚集誘導(dǎo)淬滅效應(yīng)（aggregation-caused quenching，ACQ），輻射衰減受抑制，極大地限制了它們在癌癥成像中的應(yīng)用。然而，光熱轉(zhuǎn)換依賴于分子的非輻射衰減。聚合誘導(dǎo)發(fā)光（aggregation-induced emission，AIE）技術(shù)可以很好地解決這一問題。AIE試劑在溶液中通過分子內(nèi)運(yùn)動導(dǎo)致的非輻射弛豫耗盡激發(fā)態(tài)能量。但當(dāng)AIE分子聚集時，由于空間位阻，非輻射弛豫過程受到限制，使得S1的能量通過熒光途徑到達(dá)S0。

 

光熱治療會誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞死亡，將鈣網(wǎng)蛋白、高遷移率族蛋白B1、ATP釋放至細(xì)胞外，從而招募免疫細(xì)胞。然而CD39、CD73等胞外酶會使ATP轉(zhuǎn)化為腺苷，并與免疫細(xì)胞的A2A受體（A2AR）結(jié)合以抑制其活性。因此為了進(jìn)一步提高腫瘤免疫治療療效，CD39-CD73-A2AR通路抑制劑被研發(fā)，其中AZD4635被證明具有良好的安全性和治療效果。

 

作者將TST、CPT-S-PEG、AZD4635通過共沉淀法合成納米顆粒。其中TST為此先合成的AIE分子，CPS-S-PEG為喜樹堿（CPT）與聚乙二醇（PEG）通過“-S-”連接的兩親型化合物。其治療思路（圖1）可簡單概括為：喜樹堿因含有多個共軛雙鍵與TST有強(qiáng)烈的分子內(nèi)相互作用，從而使TST的非輻射衰減受抑制，發(fā)射熒光；隨著納米顆粒被腫瘤細(xì)胞攝取，氧化還原敏感的“-S-”鍵斷裂，納米顆粒解體釋放出TST，增強(qiáng)非輻射躍遷，加速光熱轉(zhuǎn)換；隨著光熱作用，腫瘤發(fā)生免疫原性細(xì)胞死亡,此前納米顆粒釋放出的AZD4635抑制CD39-CD73-A2AR通路，增強(qiáng)免疫療效，同時喜樹堿可以抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶起到化療作用。

圖1：CAT-NP作用示意圖

 

氧化還原敏感的CPT-S-PEG可被環(huán)境中高濃度的H2O2降解，導(dǎo)致納米顆粒解體并釋放TST。釋放的TST解除了對非輻射衰減的抑制，因此CAT-NP的加熱曲線與TST-Sol的加熱曲線基本一致（圖2 A，I）。圖2 B顯示CAT-NP的光熱性能與激光功率有關(guān)。結(jié)果表明，CAT-NP的光熱性質(zhì)與其濃度有關(guān)。也就是說，納米顆粒濃度越高，光熱效率越高（圖2 C）。此外，通過測量三個連續(xù)的加熱和冷卻循環(huán)，驗證了CAT-NP的光熱再現(xiàn)性（圖2 D） 如圖2 E所示，CAT-NP為球形，粒徑約為120nm，zeta電位約為−35 mV。圖2 F、G證明了CAT-NP的熒光產(chǎn)率最高，其最強(qiáng)發(fā)射波長為1050nm。作者模擬腫瘤細(xì)胞的高過氧化氫氧化環(huán)境，研究CPT-S-PEG單鍵硫鍵斷裂釋放CPT的能力。結(jié)果表明，CPT的釋放速率取決于環(huán)境中的H2O2濃度（圖2 H）。在高過氧化氫環(huán)境中，CPT在4小時內(nèi)幾乎完全釋放（92.4%），而在低過氧化氫環(huán)境中，CPT在24小時內(nèi)僅釋放45.6%。這證明了CPTS-PEG的氧化敏感性。

 

圖2：CAT-NP光熱性質(zhì)表征

 

為了進(jìn)一步探討TST納米顆粒的抗腫瘤作用，作者對4T1細(xì)胞系進(jìn)行了一系列的初步研究。首先用MTT法研究了四種納米顆粒在808 nm激光照射下的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，四種納米粒子的細(xì)胞毒性呈濃度依賴性，即納米粒子濃度越高，細(xì)胞毒性越強(qiáng)。不同之處是沒有載TST的納米顆粒(C-NP和CA-NP)，激光照射或不照射對其細(xì)胞毒性影響不大。然而，含有TST的納米顆粒(CT-NP和CAT-NP)在激光照射后表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，尤其是CAT-NP，激光照射后對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用最強(qiáng)(圖3 A-D)。隨后細(xì)胞攝取實驗結(jié)果（圖3 E，藍(lán)色通道為Hoechst 33342標(biāo)記的細(xì)胞核，綠色通道為phalloidine標(biāo)記的細(xì)胞骨架，紅色通道為親脂性Cy5.5，紅色強(qiáng)度代表細(xì)胞攝取Cy5.5的能力。）顯示，納米顆粒組的細(xì)胞吸收效率高于自由藥物組。免疫印跡法研究了不同納米顆粒的免疫原性細(xì)胞死亡和凋亡。結(jié)果（圖3 G，CRT和HMGB1是ICD的標(biāo)記蛋白，caspase 3是凋亡的標(biāo)記蛋白）表明，CAT-NP引起的ICD和凋亡最嚴(yán)重，說明其抗腫瘤效果最好。凋亡檢測試劑盒的實驗也證明了這一點(圖3 H)。

圖3：體外抗腫瘤療效評價

 

圖4：TST納米顆粒的體內(nèi)成像

 

為了進(jìn)一步探討TST納米顆粒的體內(nèi)成像性能,當(dāng)載瘤小鼠的腫瘤（AT1）長到100-200 mm3時進(jìn)行 NIR-II成像（圖4 A）、光熱成像（圖4 B）、光聲成像（圖4 C）。NIR-II成像可以看出，納米顆粒組(DSPE-NP和CAT-NP)由于增強(qiáng)滲透性和滯留性(EPR)效應(yīng)可以被動靶向到腫瘤，而TST-Sol不能在腫瘤部位富集。此外，TST-Sol在體內(nèi)沒有長期循環(huán)作用。光熱成像證明了CAT-NP具有較好的光熱性能，移植瘤的最高溫度可達(dá)72°C。不僅如此，CAT-NP還表現(xiàn)出良好的光聲成像。

 

為了進(jìn)一步研究CPT、AZD4635和TST協(xié)同作用于癌細(xì)胞的潛在生物學(xué)機(jī)制，作者對不同處理的4T1細(xì)胞進(jìn)行了全基因組RNA表達(dá)測序(RNA-seq)。然后，通過Gene Ontology (GO)/Kyoto Encyclopedia of Genes 和 Genomes (KEGG) enrichment analysis分析，獲得不同樣品之間的生物學(xué)過程和通路差異。各組之間的基因表達(dá)關(guān)系由VENN圖顯示(圖5)。
 

圖5：不同納米顆粒處理4T1細(xì)胞的基因測序

 

作者為了研究TST納米顆粒在體內(nèi)的抗腫瘤作用，將4T1-Luciferase細(xì)胞接種于Balb/c小鼠腋下皮下。當(dāng)腫瘤達(dá)到100 mm3時，尾靜脈注射不同的納米顆粒。詳細(xì)的實驗方案如圖6 A所示。圖6 B、E是小鼠的腫瘤生長曲線的圖形,顯示CAT-NP仍顯示最好的體內(nèi)抗腫瘤作用。所有納米修復(fù)體在體內(nèi)均具有良好的安全性，未出現(xiàn)全身毒性所致的體重減輕，且心、肝、脾、肺、腎的病理切片均未發(fā)現(xiàn)異常根據(jù)小鼠的生存曲線(圖6 D)，除DSPE-NP組和CAT-NP組外，其余各組小鼠在治療開始后18天內(nèi)死亡。治療30 天后，CATNP組生存率為75%，DSPE-NP組為37.5%。在治療后第0天、第4天、第8天、第12天直接觀察腫瘤面積，圖6 F表明，CAT-NP是最有效的治療方法。然后對腫瘤組織病理切片進(jìn)行H&E、TUNEL、Ki67免疫組化染色(圖6 G)，CAT-NP引起的癌細(xì)胞凋亡和壞死最多。

 

由于AZD4635抑制腺苷生成，腺苷生成激活腫瘤免疫通路，因此采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤部位免疫細(xì)胞。如圖7 A所示，CD3是總T淋巴細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，CD8是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的標(biāo)記蛋白。圖像中的圓圈表示CTL在腫瘤部位富集，CAT-NP組吸引到腫瘤部位的CTL數(shù)量最多(4.2%)，而鹽水組(0.8%)。在圖7 B中，CD11b和Gr-1陽性的細(xì)胞群均為MDSC, MDSC在整個細(xì)胞中的比例已用紅色圈出。與生理鹽水組(42.2%)相比，CAT-NP組MDSC的比例最小(27.1%)。結(jié)果表明，CAT-NP能最大限度地抑制MDSC的生成，最有效地激活免疫細(xì)胞的反應(yīng)能力。然而，ATP通過CD39-CD73-A2AR途徑轉(zhuǎn)化為腺苷，抑制了免疫細(xì)胞活性(圖7 C)。CAT-NP與光熱治療、化療和免疫治療的協(xié)同作用最佳(圖7 E)。

 

綜上所述，為了解決目前商用熒光染料在體內(nèi)傳遞時易產(chǎn)生ACQ和淺層熒光穿透的問題，作者合成了一種兼具AIE和光熱功能的新型NIR-II分子TST。通過設(shè)計CPT-S-PEG和AZD4635與TST共組裝成納米顆粒進(jìn)行智能給藥，進(jìn)一步提高了TST的熒光產(chǎn)率和產(chǎn)熱率，實現(xiàn)了良好的光熱治療、化療和免疫治療的協(xié)同效應(yīng)。
 

圖6：抗腫瘤療效的體內(nèi)評價

 

圖7：不同納米顆粒在體內(nèi)免疫治療效果的研究

 

參考文獻(xiàn)

Adv. Sci. 2022, 2104793 DOI: 10.1002/advs.202104793

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