應(yīng)用紀(jì)要：可激活近紅外二區(qū)熒光探針開發(fā)，實(shí)現(xiàn)可靠的體內(nèi)分析物傳感

本文要點(diǎn)：基于小分子的第二近紅外 (NIR-II) 可激活熒光探針可以潛在地提供高目標(biāo)背景比和深層組織穿透。然而，由于缺乏通用且穩(wěn)定的光學(xué)可調(diào)基團(tuán)，大多數(shù)報(bào)道的 NIR-II 可激活小分子探針的通用性較差。在這項(xiàng)研究中，作者設(shè)計(jì)了 NIRII-HD，一種針對(duì) NIR-II 探針開發(fā)進(jìn)行優(yōu)化的新型染料支架。特別是，染料 NIRII-HD5 表現(xiàn)出最佳的光學(xué)特性，如適當(dāng)?shù)?pKa 值、出色的穩(wěn)定性和高 NIR-II亮度，這有利于高對(duì)比度的體內(nèi)成像。為了證明 NIRII-HD5 染料的適用性，設(shè)計(jì)了三種用于 ROS、硫醇和酶的靶向激活 NIR-II探針。使用這些新型探針，不僅在小鼠模型中實(shí)現(xiàn)了不同疾病的可靠 NIR-II 成像，而且還以高保真度評(píng)估了體內(nèi)肝損傷期間肝組織的氧化還原電位。

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圖 1. a) 報(bào)告的已激活探針平臺(tái) b) 新型活化探針平臺(tái)NIRII-HD染料的合理設(shè)計(jì)

 

圖 2. a) O-HD 和 NIRII-HD1 在 PBS 緩沖液中的歸一化吸收和發(fā)射光譜; b)50μM HClO 和 c) 5μM ONOO-的時(shí)間依賴性吸收光譜；d) 50μM HClO 和 e) 5μM ONOO- 的時(shí)間依賴性吸收光譜; f)NIRII-HD3 和g) NIRII-HD5 的歸一化吸光度與 λmax 處 pH 的對(duì)應(yīng)圖；h) ICG/O-HD (5μM) 和 NIRII-HD 染料（1-5 分別代表 NIRII-HD1-5）在 PBS（pH 7.4，含有 30% EtOH 和 1% 吐溫）中的相對(duì)吸收 i) PBS 緩沖液中染料溶液的歸一化吸收

 

[a]φ（900–1200 nm）使用 IR26 作為參考（Φf = 0.05%，二氯乙烷）; PBS 緩沖液：pH 7.4，含有 30% EtOH 和 1% tween-80

 

首先為了設(shè)計(jì)具有與 O-HD 相似性質(zhì)的 HD 類 NIR-II 染料需要：（1）增強(qiáng) O-HD 的吲哚雜環(huán)部分的供體強(qiáng)度以延長(zhǎng)其發(fā)射， (2) 在 O-HD 的破壞位點(diǎn)引入封端基團(tuán)以增加其穩(wěn)定性；(3) 降低 O-HD 或其類似物酚基的 pKa 值以增強(qiáng)其相應(yīng)分子探針的響應(yīng)性能在生理環(huán)境中。基于這些考慮，合成了新型 HD-like NIR-II 染料 NIRII-HD1-5，并且評(píng)估了表現(xiàn)最佳的染料NIRII-HD5 用于體內(nèi)成像的潛力。MTT 測(cè)定并證明 NIRII-HD5 對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有顯著影響，然后，在體內(nèi)評(píng)估 NIRII-HD5 的細(xì)胞毒性，實(shí)驗(yàn)組小鼠未出現(xiàn)任何器官損傷。

圖 3. a) 淋巴結(jié)成像示意圖 b) O-HD及其類似物（標(biāo)記為1、2和3）和NIRII-HD5（標(biāo)記為4）的結(jié)構(gòu)式 c) O-HD 及其類似物與 NIRII-HD5 在 NIR-I 或 NIR-II 熒光成像窗口對(duì)腘窩淋巴結(jié)的比較;使用 d) NIRII-HD5 和具有 (+)/不具有 (-) 激光照射和夾子阻斷的 ICG 在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)拍攝的腘窩淋巴結(jié)的熒光圖像 e) 用 (+)/不用 (-) 激光照射的腘窩淋巴結(jié)的熒光強(qiáng)度信號(hào)與從圖 3d 獲得的時(shí)間作圖

 

其次，探索了 NIRII-HD5 在活體深部組織成像方面的能力，并將成像性能與 O-HD 的成像性能進(jìn)行了比較。從活體成像中可以看到，混合溶液皮內(nèi)注射后，NIRII-HD5在NIR-II窗口（1000-1700 nm）有清晰的淋巴結(jié)成像，其SBR高達(dá)10.5 （圖 3a-3c）。相比之下，O-HD 及其兩種類似物在發(fā)射通道（695-770nm，NIR-I 區(qū)域）中顯示出弱熒光以及較差的信背比（SBR < 2.4）（圖 3c）。這些結(jié)果表明，O-HDs在活體小鼠淋巴結(jié)中的不良成像性能主要是由于NIR-I光的組織穿透力較弱和組織背景自發(fā)熒光較強(qiáng)，進(jìn)一步證明了NIRIIHD5優(yōu)越的深部組織成像能力。

 

如圖3d和3e所示，860 nm激光照射5分鐘后，NIRII-HD5仍能清晰區(qū)分淋巴結(jié)，NIRII-HD5的熒光強(qiáng)度保持不變。相比之下，ICG 在相同通量率下用 808 nm 激光激發(fā) 5 分鐘后大部分褪色，僅保留初始發(fā)射強(qiáng)度的 30%。結(jié)果表明 NIRII-HD5 具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性，這將有利于長(zhǎng)時(shí)間的體內(nèi)成像。此外，值得注意的是，腘窩淋巴結(jié)的ICG信號(hào)在照射后5分鐘即可恢復(fù)，說(shuō)明小鼠的淋巴管未受損，因此富集在小鼠足底的ICG染料可以流到小鼠足底。淋巴結(jié)再次通過(guò)淋巴管（圖3d-3e）。為了進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)，增加了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，在激光照射后用止血夾阻塞淋巴管。結(jié)果顯示，與未使用止血夾的對(duì)照組相比，ICG淋巴結(jié)信號(hào)的恢復(fù)明顯受到抑制（圖3d-3e）。

 

圖 4. a) 分別用于 ONOO-、GSH 和 ALP 檢測(cè)的三個(gè)探針的設(shè)計(jì) b) NIRII-HD5-ONOO-(5μM), e) NIRIIHD5-GSH (5μM), h) NIRII-HD5-ALP (5μM) 分別響應(yīng)生物標(biāo)志物的歸一化吸收光譜 c）NIRII-HD5-ONOO-（5μM）響應(yīng)ONOO（0-10μM）的熒光光譜 d) NIRII-HD5-ONOO- (5μM) 對(duì)各種分析物的熒光響應(yīng) f)NIRII-HD5-GSH (5μM) 響應(yīng) GSH (50–1400μM) 的熒光光譜 g) NIRII-HD5-GSH (5μM) 對(duì)各種分析物的熒光響應(yīng)

 

接著，如圖 4a 所示，基于 NIRII-HD5，開發(fā)了三種可激活的 NIR-II熒光探針 NIRII-HD5-GSH、NIRII-HD5-ONOO-和 NIRII-HD5ALP，用于檢測(cè) GSH、ONOO-和 ALP 活性，選擇這三個(gè)成像目標(biāo)是因?yàn)樗鼈兇�表三種不同類型的分析物（ROS、硫醇和酶），同時(shí)在各種生物過(guò)程中也很重要。選擇性實(shí)驗(yàn)表明，NIRII-HD5-ONOO-對(duì)ONOO-表現(xiàn)出比其他生物物種高的選擇性（圖4d），表明它可以用作ONOO-檢測(cè)的有效熒光探針。同樣，探針 NIRIIHD5-GSH 也可以在 PBS 緩沖液中被 GSH 有效激活。如圖 4e-4g 所示，在 1.4 mM GSH 存在下，NIRII-HD5-GSH 在 895 nm 的峰值處表現(xiàn)出顯著的熒光增強(qiáng)，而在添加其他生物物種后觀察到的變化可忽略不計(jì)。最后，確定 NIRII-HD5-ALP 保留了其對(duì) ALP 的響應(yīng)性。與探針 NIRII-HD5-ONOO- 和 NIRII-HD5GSH 類似，探針 NIRII-HD5-ALP 也顯示出 ALP 依賴性響應(yīng)和優(yōu)異的選擇性（圖 4h ）�？偟膩�(lái)說(shuō)，結(jié)果表明，與原始染料 O-HD 相似，新型染料 NIRII-HD5 可用作設(shè)計(jì)用于 NIR-II 傳感的可激活熒光探針的有效平臺(tái)。

 

圖 5. a) 使用 NIRII-HD5-ONOO- 探針（1：腘窩淋巴結(jié)；2：坐骨淋巴結(jié)）對(duì) LPS 誘導(dǎo)的淋巴炎癥進(jìn)行示意圖和 NIR-II熒光成像 b）隨時(shí)間推移，從 LPS 處理/鹽水處理組獲得的腘（紅圈）和坐骨神經(jīng)（藍(lán)圈）淋巴結(jié)的熒光信號(hào) c) 轉(zhuǎn)移性腫瘤誘導(dǎo)的前哨淋巴結(jié)的體內(nèi)成像 NIRII-HD5-GSH探針4T1淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型建立及腫瘤側(cè)及正常側(cè)淋巴結(jié)熒光成像示意圖。d) 圖 5c 中隨時(shí)間從腫瘤側(cè)/正常側(cè)獲得的腘窩和坐骨淋巴結(jié)的熒光信號(hào) e）正常側(cè)和腫瘤側(cè)淋巴結(jié)切片中CD206的免疫組織化學(xué)圖像

 

緊接著為了證明NIRII-HD5 衍生探針用于體內(nèi)熒光檢測(cè)的能力，NIRII-HD5-ONOO- 首次應(yīng)用于檢測(cè)脂多糖 (LPS) 皮內(nèi)注射誘導(dǎo)的淋巴炎癥小鼠模型中的 ONOO-。如圖5a所示，與生理鹽水處理的對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組腘窩和坐骨淋巴結(jié)在NIRII-HD5-ONOO-給藥后均表現(xiàn)出明顯的亮度。特別是，與對(duì)照組相比，LPS 組中腘窩淋巴結(jié)的信號(hào)在注射探針后 30 分鐘后增加了2 倍（圖 5b）。該結(jié)果表明LPS確實(shí)可以誘導(dǎo)淋巴結(jié)炎癥，探針NIRII-HD5-ONOO-可用于對(duì)該過(guò)程進(jìn)行成像。

 

為了進(jìn)一步可視化和跟蹤淋巴實(shí)體瘤轉(zhuǎn)移，通過(guò)GSH特異性反應(yīng)探針檢測(cè)到淋巴管中GSH的波動(dòng)。因此如圖 5c 所示，當(dāng)將 NIRII-HD5-GSH 注射到 4T1 荷瘤小鼠的左右后爪中時(shí)，在腘窩和坐骨淋巴結(jié)中觀察到了耀眼的 NIR-II 熒光。腫瘤側(cè)（右側(cè)），而小鼠正常側(cè)（左側(cè)）的淋巴結(jié)表現(xiàn)出弱熒光。相比之下，在正常小鼠（無(wú)荷瘤小鼠）兩側(cè)的淋巴結(jié)中檢測(cè)到幾乎相同的微弱熒光信號(hào)。量化平均強(qiáng)度顯示，腫瘤側(cè)腘窩和坐骨淋巴結(jié)區(qū)域的信號(hào)比正常側(cè)高出3倍，表明確實(shí)發(fā)生了癌細(xì)胞通過(guò)淋巴管的代謝遷移（圖5d）。這些結(jié)果證實(shí)，源自NIRII-HD5 的新型 NIR-II 探針可用作體內(nèi)疾病診斷的有效工具。
 

圖 6. a) APAP 誘導(dǎo)的肝損傷和 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 治療的示意圖 b) 分別通過(guò)探針 NIRII-HD5-GSH 和探針 NIRIIHD5-ONOO- 用鹽水、APAP 和 APAP+NAC 處理的小鼠肝臟的 NIR-II 圖像， SBR 從圖 6b 中的 c) NIRII-HD5-GSH 和 d) NIRII-HD5-ONOO- 獲得 e) 用鹽水、APAP 和 APAP+NAC 處理的小鼠肝臟的代表性組織學(xué)

 

APAP 在肝臟中進(jìn)行酶促生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生 N-乙酰基-對(duì)苯醌亞胺 (NAPQI)，該亞胺可被谷胱甘肽 (GSH) 迅速還原。APAP過(guò)量后，過(guò)量產(chǎn)生的NAPQI會(huì)消耗GSH，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白直接結(jié)合，導(dǎo)致線粒體功能受到干擾，釋放出大量ROS（如ONOO-），此外，N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 作為一種保肝藥物，可產(chǎn)生 GSH 來(lái)抵消 APAP 引起的肝臟氧化應(yīng)激（圖 6a）。最后檢查了 NIRII-HD5 探針（NIRII-HD5-GSH 和 NIRII-HD5-ONOO-）是否可以監(jiān)測(cè)這一過(guò)程體內(nèi)具有 NIR-II 成像。如圖 6b 和 6c 所示，用鹽水處理的正常 Balb/c 小鼠在施用 NIRII-HD5-GSH 后在肝臟中顯示出高熒光。在用 300 mg kg-1 APAP 預(yù)處理 12 小時(shí)后，在小鼠肝臟中觀察到 NIR-II熒光顯著降低。相比之下，探針NIRII-HD5-ONOO- 在藥物刺激前后小鼠肝臟中表現(xiàn)出相反的熒光變化（圖 6b 和 6d）。這些結(jié)果表明，隨著藥物性肝毒性的發(fā)生，小鼠肝臟中的GSH被消耗，肝臟組織中的ROS（ONOO-）顯著增加。小鼠先用 300 mgkg-1 APAP 預(yù)處理誘導(dǎo)肝損傷，然后用 NAC (600 mg kg-1) 治療，與僅接受 APAP (300 mg kg-1) 的小鼠相比，NIRIIHD5-的熒光顯著增強(qiáng)觀察到 GSH 和 NIRII-HD5-ONOO- 明顯減少。

 

參考文獻(xiàn)

Angew Chem Int Ed Engl. 2022 Feb 25:e202201541. doi:10.1002/anie.202201541. Epub ahead of print. PMID: 35218130.

 

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