細(xì)胞培養(yǎng)基本操作步驟

細(xì)胞培養(yǎng)是生物醫(yī)藥科研工作者要掌握的基本技能，也是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，了解細(xì)胞培養(yǎng)基本操作要領(lǐng)對(duì)于生物醫(yī)藥科研工作者，尤其是從事基礎(chǔ)研究的科研人員尤為重要。本文將從實(shí)際操作角度談?wù)勼w外細(xì)胞培養(yǎng)過程中的操作要領(lǐng)。

　　從臍帶華通氏膠組織分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞

　　1.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

　　正常細(xì)胞生長環(huán)境為5%二氧化碳，恒溫37℃以及飽和濕度。開始進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)前，實(shí)驗(yàn)者要查閱資料，了解所要培養(yǎng)細(xì)胞的生長習(xí)慣，如貼壁、半貼壁、懸浮等。了解細(xì)胞生長的營養(yǎng)條件，大部分細(xì)胞是10%胎牛血清+89%培養(yǎng)基+1%抗生素。當(dāng)然，培養(yǎng)基細(xì)分有很多種類，如高糖、低糖、分化培養(yǎng)基、干細(xì)胞培養(yǎng)基等。根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的生長條件，預(yù)先選擇合適的耗材，如促貼壁或低吸附培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。在處理細(xì)胞前，算好本次處理所需的細(xì)胞生長培養(yǎng)基總量，生長培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用。

　　2.細(xì)胞消化

　　對(duì)于貼壁類細(xì)胞，傳代相較于懸浮細(xì)胞操作步驟多，應(yīng)避免不必要的細(xì)胞污染發(fā)生。細(xì)胞生長匯合度80-90%左右時(shí)即可進(jìn)行傳代操作。因?yàn)榧?xì)胞生長有濃度依賴性，過完或過早傳代都會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)。培養(yǎng)箱取出細(xì)胞，PBS清洗2遍。這時(shí)要將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的液體吸凈，可以用真空泵、移液管、一次性吸管等，但是無論用什么方式吸凈，都要避免操作手觸碰瓶口而造成污染，避免吸頭觸碰細(xì)胞面而對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷。吸凈液體后，加入適量的胰蛋白酶。胰蛋白酶不宜過多，只需幾滴，傾斜培養(yǎng)瓶后能將細(xì)胞面覆蓋即可。此時(shí)可將細(xì)胞放在培養(yǎng)箱中，37℃的條件有助于胰蛋白酶發(fā)揮消化作用。消化時(shí)間在2分鐘左右即可。當(dāng)然有的細(xì)胞較容易消化，可能消化過程只需30秒，如TC-1、MC-38等腫瘤細(xì)胞株；有的細(xì)胞消化較慢，如原代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。另外，如何判斷細(xì)胞消化過程是否結(jié)束？我們可以在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞大部分從多角形變?yōu)槁褕A形，并見細(xì)胞漂浮。也可以通過肉眼直接觀察細(xì)胞面由光滑向毛玻璃狀變化。這是可以加入適量完全培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，基本上加入3-5毫升即可。加入后輕輕吹吸后轉(zhuǎn)移到離心管進(jìn)行離心，基本上1000轉(zhuǎn)離心3分鐘細(xì)胞就能分離下來，轉(zhuǎn)速不宜過高，否則會(huì)有細(xì)胞碎片跟著離心下來。離心結(jié)束后，棄上清液。這時(shí)可以直接倒，然后用移液槍把殘留液體洗凈。

　　3.接種

　　將以上得到的細(xì)胞沉淀重懸�？梢越柚�漩渦震蕩儀來重懸，也可以在重懸細(xì)胞前手指輕彈離心管底部，再加入適量培養(yǎng)基重懸，切忌直接加入培養(yǎng)基后用移液槍去吹打。重懸好的細(xì)胞均分到2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)全生長培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。T25瓶培養(yǎng)液總量8-10毫升左右，T75瓶培養(yǎng)液總量20-25毫升左右。接種后，十字混勻，并每天鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞細(xì)胞傳代比例是可以根據(jù)細(xì)胞生長規(guī)律調(diào)整的，如生長較快的腫瘤細(xì)胞株，可以按照1：5，甚至1：10的比例傳代。當(dāng)然原代分離培養(yǎng)的細(xì)胞生長較慢，可以1：2，甚至2：3傳代。