單細(xì)胞打印機(jī)在高產(chǎn)細(xì)胞株篩選、基因治療、抗體藥物開發(fā)中的應(yīng)用

提升高產(chǎn)細(xì)胞株篩選效率，助力基因治療、抗體藥物等工藝開發(fā)——單細(xì)胞打印機(jī)

目前全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展處于快速上升期，后疫情時(shí)代的醫(yī)藥健康行業(yè)，迎來新一輪的變革與機(jī)遇。其中，抗體藥物、細(xì)胞與基因治療藥物被認(rèn)為是未來醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的主力軍。無論是抗體藥物的生產(chǎn)還是基于病毒載體的基因治療藥物的制備，都涉及單克隆細(xì)胞株的篩選。在工藝開發(fā)過程中，研發(fā)人員需要分離單細(xì)胞克隆，篩選出高產(chǎn)且穩(wěn)定的細(xì)胞株來建立種子細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫，用于后續(xù)的病毒載體或抗體等藥物的生產(chǎn)。

2020年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）更新了關(guān)于基因治療臨床試驗(yàn)申請(INDs)的化學(xué)、制造和控制指導(dǎo)原則（Chemistry, Manufacturing, and Control Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications），內(nèi)容包含穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株開發(fā)及細(xì)胞克隆性確證等。文件指出，細(xì)胞庫（Cell bank）的穩(wěn)定性及純度是一個需要考慮的重要方面（https://www.fda.gov）。非單克隆來源的細(xì)胞群中，其細(xì)胞異質(zhì)性相對較高，外源蛋白產(chǎn)量低的細(xì)胞系往往與蛋白高產(chǎn)的細(xì)胞群體競爭，導(dǎo)致高產(chǎn)細(xì)胞個體占比越來越少，最終隨著傳代次數(shù)的增加，導(dǎo)致細(xì)胞庫或工作庫的質(zhì)量下降，因此，通過單克隆細(xì)胞篩選是提高病毒載體質(zhì)量的重要步驟。單克隆源性的確證是一種控制細(xì)胞種群降低其異質(zhì)性的方法，通過防止異種細(xì)胞群體的產(chǎn)生，來保障未來生產(chǎn)出的病毒產(chǎn)品的質(zhì)量不受影響。CEVEC公司（CEVEC Pharmaceuticals）針對 ELEVECTA® AAV包裝細(xì)胞系的研究數(shù)據(jù)顯示，通過單克隆篩選出的細(xì)胞株其AAV產(chǎn)量要比非單克隆細(xì)胞來源的高10倍左右（https://cevec.com）。除了細(xì)胞基因治療產(chǎn)品，針對抗體藥物，F(xiàn)DA的政策法規(guī)也要求工藝生產(chǎn)細(xì)胞系須是從單個祖細(xì)胞克隆來源的，生物制藥企業(yè)需提供有力的數(shù)據(jù)證據(jù)以證明藥物研發(fā)過程中的單克隆源性，上述相關(guān)的政策法規(guī)對藥物開發(fā)制備工藝中細(xì)胞單克隆篩選操作及細(xì)胞單克隆源性確證提出了更高的要求。

目前常見的單克隆細(xì)胞篩選方法，包括有限稀釋法、半固體培養(yǎng)基篩選法、流式細(xì)胞術(shù)分選及單細(xì)胞分離法等。有限稀釋法、半固體培養(yǎng)基篩選法的優(yōu)點(diǎn)是對細(xì)胞的物理損傷小，弊端是耗時(shí)長、效率低，此外，半固體培養(yǎng)基篩選法采用的熒光抗體對細(xì)胞有毒性，會影響細(xì)胞活性；并且在半固體培養(yǎng)基上篩選出的高產(chǎn)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)可能并不高產(chǎn)。流式細(xì)胞術(shù)的分選效率高，但是由于流式細(xì)胞術(shù)分選采用的內(nèi)部壓力及其高頻震蕩對細(xì)胞造成的損傷較大，分選下來的細(xì)胞活性不高。篩選過程對細(xì)胞的物理或化學(xué)損傷是造成細(xì)胞單克隆率降低的原因之一，除此之外，篩選前細(xì)胞的狀態(tài)對于篩選后是否形成高產(chǎn)的細(xì)胞群落也很重要，若是篩選前細(xì)胞狀態(tài)已經(jīng)不好，篩選后其狀態(tài)也難以變好，何況篩選過程會對細(xì)胞造成一定的損傷，更不會奢望其狀態(tài)會變好。

綜上所述，尋找一種分選效率高，篩選出的陽性克隆細(xì)胞成活率高、生長率高，且單克隆源性證據(jù)可追溯的篩選方法或技術(shù)平臺對于涉及單克隆細(xì)胞篩選的基因治療、抗體等生物醫(yī)藥行業(yè)顯得尤為重要。

德國 Cytena 公司開發(fā)的單細(xì)胞打印機(jī)（SCP）采用的芯片包含專利的硅膜設(shè)計(jì)，電子控制的制動板輕輕擠壓腔體導(dǎo)致腔體體積變小，產(chǎn)生液滴，通過高分辨率的CCD相機(jī)確認(rèn)只含一個細(xì)胞且該細(xì)胞直徑和細(xì)胞圓度符合設(shè)定范圍的液滴落進(jìn)96/384孔板中，不含細(xì)胞的空液滴和含兩個及以上細(xì)胞的液滴被氣動閥門吸走。通過設(shè)定細(xì)胞直徑和細(xì)胞圓度的質(zhì)控分選過程，不僅提高了單細(xì)胞的分選效率，也篩選到了狀態(tài)更好的細(xì)胞，提高了單克隆細(xì)胞的生長率。
 

圖1. Cytena 單細(xì)胞打印機(jī)工作原理圖

單細(xì)胞的證據(jù)可追溯性，在cartridge分離細(xì)胞前后的過程中，會連續(xù)拍取多張細(xì)胞圖片，證實(shí)克隆來自于單個細(xì)胞。
 

Cytena單細(xì)胞打印機(jī)進(jìn)入國內(nèi)以來，受到國內(nèi)各大藥企的青睞，得到了眾多用戶的的積極反饋和認(rèn)可。

具體案例分享
 

一、下面給出了不同地區(qū)一些客戶反饋的單細(xì)胞克隆成活率及單克隆細(xì)胞拍照圖。
 

圖3. 不同客戶使用Cytena單細(xì)胞打印機(jī)得到的單細(xì)胞克隆成活率數(shù)據(jù)
 

（1）杭州客戶
 

（見下圖）左圖為單細(xì)胞打印機(jī)分選后Day14天拍照圖， 右圖為有限稀釋法分選后Day14天拍照圖。
 

結(jié)論：SCP分選出的細(xì)胞幾乎都是單細(xì)胞，有限稀釋大部分都是空孔。SCP長出來的單克隆數(shù)（70個）幾乎是有限稀釋的4倍（18個）。

（2）南京客戶
 

一共分選2組樣品，在有限稀釋法分選很難生長的細(xì)胞，通過SCP分選后，都獲得了66-75個單克隆細(xì)胞株，證實(shí)SCP通過細(xì)胞直徑，細(xì)胞圓度等質(zhì)控方式能篩選到狀態(tài)好的細(xì)胞，提高單克隆率。

（3）上�？蛻�
 

單細(xì)胞打印機(jī)分選的 96 孔板最終獲得的克隆數(shù)目是有限稀釋法的 4.3 倍。
 

（4）東北客戶
 

SCP的分選效率高（如下圖所示），除了周邊孔受到蒸發(fā)效應(yīng)影響生長，中間的孔都是單克隆來源的細(xì)胞，且生長良好。（細(xì)胞類型：CHO細(xì)胞）
 

（5）成都客戶
 

 

二、客戶評價(jià)
 

三、部分客戶名單
 

貨物名稱	儀器型號	最終用戶
單細(xì)胞打印機(jī)	scp	藥明生物
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight	信達(dá)生物
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight	蘇州康聚生物
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight	君盟生物
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight	齊魯制藥上海研發(fā)中心
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight	北京昭衍生物
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight	成都康諾行生物醫(yī)藥科技有限公司
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight	三優(yōu)生物醫(yī)藥
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight	深圳樂士生物科技有限公司
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight	中國科學(xué)院藥物創(chuàng)新研究院中山研究院（達(dá)石）
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight	煙臺邁百瑞國際生物醫(yī)藥有限公司
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight	澤景生物
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight	皓陽生物
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight	科望生物
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight	麗珠生物
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight	復(fù)宏漢霖
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight	宜明昂科
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight	養(yǎng)生堂
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight	智享生物
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight	尚健生物
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight	寶船生物
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight	再鼎生物
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight	康寧杰瑞
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight	艾米能斯
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight2.0	漢騰生物
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight2.0	鼎康生物（武漢）
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight2.0	海正生物
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight2.0	艾迪基因
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight2.0	武漢大學(xué)
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight2.0	長春金賽
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight2.0	特瑞斯
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight2.0	康抗生物
單細(xì)胞打印機(jī)	c.sight2.0	至善唯新生物科技
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight2.0	中科新生命
單細(xì)胞打印機(jī)	Up.sight	深圳科興
單細(xì)胞打印機(jī)	f.sight2.0	綠葉派諾

Cytena公司潛心研究單細(xì)胞打印機(jī)技術(shù)多年，不斷升級設(shè)備功能，以一貫溫和的分選原理、更加快速的分選效率、更加簡易的操作步驟，助力抗體、細(xì)胞治療、基因治療、干細(xì)胞等研究領(lǐng)域的客戶快速搭建單細(xì)胞篩選平臺。艾貝泰生物科技有限公司作為Cytena的單細(xì)胞打印機(jī)總代理商，為您提供最優(yōu)質(zhì)的售前售后服務(wù)。