細胞培養(yǎng)的注意事項及常見問題與解答

一、無菌操作

細胞培養(yǎng)最看重的就是無菌操作，無菌操作是細胞培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵點。

1、使用前用75%的乙醇擦拭細胞間的桌面、超凈臺、孵箱和離心機等；紫外照射細胞間和超凈臺30分鐘以上才可以進入使用。

2、進入細胞間必須穿上隔離服或者細胞間專用的白大衣，戴上手套和口罩，換上拖鞋，嚴格意義上來說，帽子也是要帶的。除了隔離服，其他穿著物品最好一次性使用。

3、凡是放入超凈臺中的不是一次性使用的物品事先都需要經(jīng)過高壓滅菌；不能進行高壓處理的物品也需要經(jīng)過75%的乙醇消毒。包括酒精燈、吸管、移液器、試管架、培養(yǎng)皿、廢液缸等。

4、操作過程中盡量接近酒精燈；用鑷子拿取槍頭、離心管、吸管等物品時，避免碰到使用端；不要在開口器皿的上端進行操作。

5、細胞間的設(shè)計都是一層層的隔間，每一層隔間的拉門都必須關(guān)好；當(dāng)有人在超凈臺工作時，其他人員不允許進入操作區(qū)域。

二、培養(yǎng)基

1、培養(yǎng)基的選擇依細胞種類而定。如果是從別的實驗室借來的細胞，最初階段一定要保持細胞原有的培養(yǎng)條件；特殊種類的細胞，比如內(nèi)皮細胞，可以借鑒網(wǎng)上培養(yǎng)成功的條件，添加一些特定成分。

2、液體培養(yǎng)基的保存條件應(yīng)是冰箱4度冷藏。小六兒見過有的大實驗室細胞量多，一次性購買的培養(yǎng)基瓶數(shù)也多，有些人可能覺得-20冰箱保存時間會更久一些。但是經(jīng)過冷凍后的培養(yǎng)基再溶化時，你會發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的顏色發(fā)生變化，顏色變深，這就是培養(yǎng)基的PH值升高了。

3、培養(yǎng)基中都含有大量的谷氨酰胺，用來合成細胞生長所需要的核酸和蛋白質(zhì)。但是谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定，保存4周后的培養(yǎng)基需要重新加入谷氨酰胺。所以盡量不要大批量購買培養(yǎng)，也不要一次配太多的培養(yǎng)基。

4、細胞適合的培養(yǎng)基PH值是7.2-7.4，偏高或偏低都不好，但相對于堿性條件而言，細胞更耐酸。原代細胞對PH值的變化很敏感，而永生性細胞相對來說忍受力更強一些。

5、造成皿或瓶內(nèi)培養(yǎng)基PH值變化的原因有很多：細胞增殖速度的快慢、孵箱內(nèi)二氧化碳的濃度不準確、培養(yǎng)瓶的蓋子擰緊或者發(fā)生了污染。如果發(fā)現(xiàn)細胞生長過慢，刨除細胞本身狀態(tài)的原因，可以在培養(yǎng)液中添加丙酮酸鈉（丙酮酸鈉是糖酵解的中間產(chǎn)物，為細胞生長提供ATP，提供合成大代謝所需要的碳源，使用濃度通常是0.1mM）。

6、細胞發(fā)生污染，培養(yǎng)基的PH值也會發(fā)生變化。如果新配置的培養(yǎng)基出現(xiàn)沉淀，很可能是廣口瓶沒有清洗干凈，瓶中殘留的磷酸鹽造成培養(yǎng)基成分的析出。

7、孵箱內(nèi)濕度對維持培養(yǎng)基的滲透壓也有很重要的作用。大部分細胞適應(yīng)的滲透壓在260-320mOsm/kg。濕度不夠時，培養(yǎng)基蒸發(fā)，液體的滲透壓就會升高。

8、培養(yǎng)基在使用前需提前從冰箱拿出，使其恢復(fù)至室溫或者37度水浴。

9、操作過程中，如果槍頭中已經(jīng)有培養(yǎng)基或其他液體成分，不要再經(jīng)過酒精燈被高溫加熱。高溫不僅會使有效成分失效，更有可能產(chǎn)生有毒物質(zhì)。

10、我們購買的培養(yǎng)基瓶上都會標注避光保存，這是因為培養(yǎng)基中的某些成分遇光會產(chǎn)生過氧化氫，具有細胞毒性。我們在超凈臺中處理細胞時，因為時間較短，不會產(chǎn)生太大問題。但是如果長時間放置在室外或燈光下照射，或者有的冷藏冰柜的門是玻璃的，就會造成培養(yǎng)基質(zhì)量的下降。 

三、血清

1、血清分為：

a)新生牛血清（新生的小牛5天內(nèi)取血）；

b)小牛血清（16周內(nèi)的小牛取血）；

c)胎牛血清（剖腹取出胎兒制成的）。

2、我們買來的血清多處于冰凍狀態(tài)，滅活前放到4度冰箱，使其緩慢溶化。56度水浴45分鐘滅活，滅活后冷卻至室溫再放回冰箱冷凍層中。滅活是滅活補體系統(tǒng)中具有蛋白酶活性的成分，對于一些難養(yǎng)的細胞，滅活補體是很重要的。但是滅活的溫度也可能會破壞血清中的生長因子，所以到底該不該滅活血清，還沒有一個很明確的標準，可能還是要視情況而定吧。

3、血清在溶化過程中，纖維蛋白原會轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，所以有時我們會看到絮狀物，但是這種情況是不影響血清的質(zhì)量的。

四、傳代

1、貼壁細胞傳代時，先用消化液潤洗一遍；棄掉后，再加入適量消化液置于孵箱或鏡下觀察消化；當(dāng)細胞變圓，彼此之間產(chǎn)生空隙，加入等量或大量的培養(yǎng)基終止消化，培養(yǎng)基中的血清可以抑制胰蛋白酶的活性。

2、這里我沒有明確提到胰蛋白酶的濃度，并不是說濃度越高越好。胰蛋白酶底物的特異性差，會破壞細胞膜成分。PH8.0，37度環(huán)境下，消化液的消化能力是最強的。培養(yǎng)基中的血清會降低胰酶的消化能力，所以每次消化前，也要用PBS反復(fù)沖洗干凈培養(yǎng)皿。日常用的比較多的消化液濃度：

a)0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA

b)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA 

c)0.25%胰蛋白酶

3、傳代后如果細胞不貼壁，可能的原因是胰蛋白酶消化過度或者沒有清洗干凈EDTA。

4、懸浮細胞傳代時，正常收集細胞、離心濃縮、用培養(yǎng)基重懸就可以了。懸浮細胞每次換液都需要離心重懸，但是由于懸浮細胞一般會處于單細胞層生長，有的時候生長速度很快，重懸后如果不晃動培養(yǎng)皿，就會看到細胞成團；如果經(jīng)常顯示懸浮細胞大量抱團生長，也有可能是培養(yǎng)基中的血清問題、或者鈣鎂離子濃度的變化造成了細胞間的粘附力改變。

五、細胞死亡及生長異常

1、首先講一下細胞生長緩慢的原因：

a)更換了血清或者培養(yǎng)基，細胞需要一段時間適應(yīng)一下；

b)由于細胞的特殊種類，培養(yǎng)基中缺少某些生長因子；

c)培養(yǎng)基中有少量真菌或者細菌污染；

d)傳代的時候細胞密度過低；

e)細胞狀態(tài)老化；

f)支原體污染。

2、解決上述問題的方法：

a)如果實驗室沒有某種細胞最適宜的培養(yǎng)基，可以先用原培養(yǎng)條件凍存一些，然后逐漸增加新的培養(yǎng)基比例，25%、50%、75%到100%，傳代3-5次后，讓細胞慢慢適應(yīng)。

b)判斷是不是培養(yǎng)基發(fā)生污染，可以先不加抗生素，觀察細胞狀態(tài)。

c)增加細胞的接種密度。

d)發(fā)現(xiàn)細胞老化的時候，及時更換新的細胞。

e)如果懷疑是支原體污染，一定要隔離疑似污染的培養(yǎng)皿，及時清潔消毒孵箱。

3、造成細胞死亡的原因：

a)細胞消化過度；

b)沒有及時換液，營養(yǎng)成分消耗殆盡；

c)如果前一天細胞的狀態(tài)很好，換液之后就全死了，應(yīng)該考慮是否是培養(yǎng)基或者血清的問題。

4、如何判定細胞是否發(fā)生支原體污染：可以選用直接培養(yǎng)法、熒光染色或PCR方法檢測，比較常用的是PCR。當(dāng)細胞發(fā)生支原體污染時，原則上是能夠去除支原體的，但是整個過程耗時耗力，還要考驗個人操作能力。所以如果不是處于細胞存量很少的情況下，建議發(fā)現(xiàn)污染時立刻棄掉，重新培養(yǎng)。

5、如果孵箱中只是某種細胞持續(xù)性大量死亡，而其他細胞狀態(tài)都沒問題的話，基本上可以確定就是孵箱存在特異性感染這類細胞的真菌或細菌，遇到這種情況，小六兒也不知道該怎么做，只能是先停一段時間看看。。。。。。

6、其他注意事項：每個星期都要更換孵箱底盤中的水（紫外照射后超純水）；每兩周消毒一次孵箱：75%酒精擦拭一遍后，再用0.1%新潔爾滅擦拭一遍（都用超純水配制）；可以在孵箱底部放一個燒杯，里面放入飽和硫酸銅，可以抑制霉菌生長。不過也有人說硫酸銅會改變孵箱的PH值，如果不是孵箱污染的情況很嚴重，建議不要使用。