蛋白磷酸化修飾的研究方法與應(yīng)用

蛋白質(zhì)是細胞的功能分子，基因功能的執(zhí)行者，從核糖體剛翻譯出來的蛋白質(zhì)是沒有功能的，需要到達細胞的指定位置（胞內(nèi)、胞外，和不同的亞細胞器等）并形成特定的空間結(jié)構(gòu)，才能發(fā)揮其功能作用。翻譯過程會發(fā)生不同類型以及水平的蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMs; 在UniProt數(shù)據(jù)庫中報告了400種以上翻譯后修飾種類，真核生物中有326種，細菌中有250種，古生菌中有80種）。PTM在幾乎所有細胞過程中都起著至關(guān)重要的作用，包括細胞周期、降解、凋亡、細胞信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄等（圖1）。
 

圖1. 翻譯后修飾（PTM）種類

既然蛋白修飾扮演者如此重要的角色，那小編就跟大家說道說道了，這次咱先從最常見的磷酸化修飾說起吧。

技術(shù)簡介
蛋白質(zhì)磷酸化(Phosphorylation)是由蛋白質(zhì)激酶催化的把ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基（Ser、Thr、Tyr）上的過程，或者在信號作用下結(jié)合GTP，是生物體內(nèi)一種普通的調(diào)節(jié)方式，細胞內(nèi)有超過30%的蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化修飾，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控細胞增殖、發(fā)育、分化、凋亡過程中起重要作用。磷酸化通常比其他翻譯后修飾受到更大的關(guān)注，部分原因是激酶在疾病，尤其是癌癥中經(jīng)常過表達或突變。因此，許多抑制劑和抗體被開發(fā)出來對抗激酶的活性。

磷酸化由激酶催化，去磷酸化由磷酸酶作用執(zhí)行，如圖2所示：

圖2. 蛋白磷酸化與去磷酸化過程

如此重要的修飾過程，我們?nèi)绾稳ジ�好的進行相關(guān)研究呢？

研究方法
磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)是主要的研究手段， 質(zhì)譜法是鑒別蛋白磷酸化位點和定量磷酸化變化的關(guān)鍵工具。磷酸化肽段的富集對于成功的磷酸肽MS 分析至關(guān)重要。目前富集方法包括TiO2富集方法、抗磷酸酪氨酸抗體、固定化金屬親和層析（IMAC）、化學(xué)修飾和強陽離子交換層析（SCX）等。

如圖3展示了磷酸化肽段的傳統(tǒng)富集方法，它們各有什么優(yōu)缺點呢？

1、高親和力的IP抗體可以識別不同氨基酸的磷酸化位點，但每種抗體都對周圍的氨基酸有一定的偏向性，因此使用多種抗體進行IP會增加磷酸蛋白質(zhì)組的覆蓋率。

2、二氧化鈦（TiO2）制備時間更短，并提供更大的容量。由于該方法利用了與IMAC相同的原理，因此它同樣容易非特異性保留酸性非磷酸化肽。

3、IMAC富集方法是基于磷酸基團對Fe3+Zn2+和Ga3+等金屬離子的高親和力。主要局限性在于非磷酸化酸性肽的非特異性保留，將羧酸基團轉(zhuǎn)化為酯可有效消除非磷酸化肽在IMAC柱上的非特異性保留。該方法能夠在較低的響應(yīng)范圍內(nèi)檢測磷酸肽。由于不同的金屬離子對不同的磷酸化肽亞群富集效率不同，因此可通過對不同金屬的多次分析，或通過在單個IMAC富集步驟中混合多種金屬離子，獲得磷酸蛋白質(zhì)組的最大覆蓋率。

圖3. 磷酸化肽段富集方法

最重要的磷酸化肽富集工作完成之后，就可以準(zhǔn)備上機檢測啦，質(zhì)譜檢測的方法也是多種多樣：

1.Label free方法：無需標(biāo)記，不限樣本適量，母離子峰強度定量；

2.TMT方法：MS2定量準(zhǔn)確度高，二級色譜分餾深度檢測；

3.DIA方法：MS2定量準(zhǔn)確度高，重復(fù)性大幅度提高，更少缺失值。

如何選擇，那就看檢測的樣本數(shù)量以及蛋白含量，樣本平行性等等因素啦~

技術(shù)應(yīng)用
最后要跟大家聊的是，修飾組學(xué)與其他組學(xué)如何搭檔，實現(xiàn)數(shù)據(jù)的升華呢？

修飾組學(xué)+常規(guī)蛋白組
最常見的是修飾組學(xué)與常規(guī)蛋白組聯(lián)合分析，因為從單一組學(xué)層面去分析僅能得到一個分子層面的數(shù)據(jù)，不能說明具體變化的主角是整個蛋白水平還是修飾水平，因此兩個組學(xué)的聯(lián)合分析對于系統(tǒng)深入的分子機制研究是至關(guān)重要的。

案例：機體晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)因子的新發(fā)現(xiàn)

PMID:32054765 Science 20200214;367(6479)

晝夜節(jié)律(約24小時)在調(diào)節(jié)日常生理方面起著重要作用。轉(zhuǎn)錄因子Bmal1是哺乳動物生物鐘的主要驅(qū)動因子，是作為機體主要的分子計數(shù)器的關(guān)鍵部分。美國賓夕法尼亞大學(xué)Akhilesh B. Reddy發(fā)現(xiàn)，通過深度TMT蛋白組、磷酸化蛋白組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究［4］，在Bmal1基因敲除小鼠中，即使沒有外界刺激(如光或溫度的變化)，其也會影響身體的周期變化，預(yù)示著生物時鐘的其他驅(qū)動因素也是存在的。
 

修飾蛋白組+其他組學(xué)

它們兩個搭檔，可以講述出更加精彩的故事，比如修飾蛋白組與轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合分析，逐步揭開生命活動機理的神秘面紗：

案例：BET抑制可阻斷炎癥誘導(dǎo)的心功能不全和SARS-CoV-2感染

PMID: 33811809 Cell 20210415;184(8)

COVID-19冠狀病毒疾病患者發(fā)生心臟損傷和功能障礙，并增加死亡率。病因尚不明確，但可能是直接的心臟感染和/或炎癥引起的功能障礙。為了確定機制和心臟保護藥物，作者應(yīng)用磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)和單核RNA測序技術(shù)進行研究，最終確定干擾素γ、白細胞介素1β和聚 (I:C)的聯(lián)合作用誘導(dǎo)心臟舒張功能障礙。
 

1.方法優(yōu)化升級，更高深度數(shù)據(jù)檢測，修飾位點鑒定數(shù)量大幅度提升；

2.強大的研發(fā)團隊，多年質(zhì)譜經(jīng)驗積累，穩(wěn)居行業(yè)領(lǐng)先水平；

3.全方位服務(wù)，多角度售后，協(xié)助文章發(fā)表。

哈哈，老師們現(xiàn)在是不是已經(jīng)摩拳擦掌，躍躍欲試了呢，樣本可以準(zhǔn)備起來啦，期待與您的合作~