人巨細(xì)胞性肺癌細(xì)胞801-D培養(yǎng)常見問題

問題1：培養(yǎng)液pH值變化太快

細(xì)胞結(jié)構(gòu)：

可能原因及解決辦法

（1）CO2張力不對(duì)

按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對(duì)應(yīng)CO2濃度為5％到10％。

（2）培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊

松開瓶蓋1/4圈。

（3）NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足

改用不依賴CO2培養(yǎng)液。加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度。

（4）培養(yǎng)液中鹽濃度不正確

5637(人膀胱癌細(xì)胞)在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks鹽配制的培養(yǎng)液。

（5）細(xì)菌、酵母或真菌污染

丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。

問題2：培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變

可能原因及解決方法

（1）洗滌劑清洗后殘留有磷酸鹽，將培養(yǎng)基成分沉淀下來

用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后滅菌。

（2）冰凍保存培養(yǎng)液

將培養(yǎng)液加熱到37℃，搖動(dòng)使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。

問題3：培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時(shí)pH發(fā)生變化

可能原因

細(xì)菌或真菌污染

建議解決方法

丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。

1、首先，觀察細(xì)胞培養(yǎng)瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象。若有，請(qǐng)拍照，并及時(shí)與技術(shù)支持聯(lián)系（所拍照片將作為后續(xù)服務(wù)依據(jù)）。

2、用75%酒精擦拭細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問題，部分貼壁細(xì)胞會(huì)有少量從瓶壁脫落；先不要打開培養(yǎng)瓶蓋，將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2-4小時(shí)，以便穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

3、仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如貼壁特性（貼壁/懸浮）、細(xì)胞形態(tài)、所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子、傳代比例、換液頻率等。

4、靜置完成后，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，鏡檢、拍照，記錄細(xì)胞狀態(tài)（所拍照片將作為后續(xù)服務(wù)依據(jù)）；建議細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，定期拍照、記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

5、貼壁細(xì)胞：若細(xì)胞生長(zhǎng)密度超過80%，可正常傳代；若未超過80%，移除細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基，預(yù)留5ml左右繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞密度達(dá)80%左右再進(jìn)行傳代操作，瓶蓋可稍微擰松。

6、懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)液體全部轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管內(nèi)，1200rpm離心5min，離心后上清培養(yǎng)基可收集備用，管底細(xì)胞沉淀加入5ml培養(yǎng)基吹打、重懸。鏡檢時(shí)，若細(xì)胞密度超過80%，可將細(xì)胞懸液分至2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，補(bǔ)加培養(yǎng)基至5ml；若細(xì)胞密度未超過80%，將細(xì)胞懸液移至原瓶繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)再進(jìn)行傳代操作。

注意事項(xiàng)：

1、可將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)多余的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管中，備用；細(xì)胞首次傳代時(shí)，可以將該培養(yǎng)基按照一定比例和客戶自備的培養(yǎng)基混合使用，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)培養(yǎng)條件。

2、確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)良好后，應(yīng)及時(shí)將部分細(xì)胞凍存，再進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，避免后期實(shí)驗(yàn)失誤可能發(fā)生細(xì)胞污染或死亡而導(dǎo)致的細(xì)胞丟失，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3、建議客戶收到細(xì)胞后前3天，100X、200X、400X各拍3張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于后續(xù)和技術(shù)支持溝通交流。

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