移取PCR Master Mix對(duì)qPCR結(jié)果的準(zhǔn)確性的影響

定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）分析具有高靈敏度，這是其成功并廣泛應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)室的最重要原因之一。然而，包括移液技術(shù)在內(nèi)的許多因素都會(huì)對(duì)qPCR分析的結(jié)果產(chǎn)生影響。在進(jìn)行基于PCR原理的分析實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)于Master Mix的移液需重點(diǎn)關(guān)注良好的移液技術(shù)及耗材的正確選擇，從而獲得可重現(xiàn)且可靠的結(jié)果。

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《如何移液PCR Master Mix以提高qPCR結(jié)果的準(zhǔn)確性》應(yīng)用說明中使用賽多利斯 Tacta® 手動(dòng)移液器和Picus® 電動(dòng)移液器進(jìn)行了測(cè)試，證明使用低吸附移液器吸頭搭配正向移液技術(shù)或使用標(biāo)準(zhǔn)移液器吸頭搭配反向移液技術(shù)對(duì)Master Mix進(jìn)行移液可獲得良好的精準(zhǔn)度和準(zhǔn)確度，使用電動(dòng)移液器確保了移液速度及結(jié)果的重現(xiàn)性。
引言
基于PCR原理的應(yīng)用已成為生物制藥工藝、臨床診斷和學(xué)術(shù)研究的關(guān)鍵手段。然而，在執(zhí)行定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）時(shí)，分析結(jié)果的可變性可能是個(gè)問題。

在qPCR準(zhǔn)備階段，對(duì)Master Mix試劑進(jìn)行移液具有挑戰(zhàn)性。Master Mix通常由聚合酶、dNTP、MgCl2以及可能含有吐溫和甘油成分的緩沖液組成。由于Master Mix必須在冰上存放，所以液體有點(diǎn)粘稠和冰冷，這些特性使得移取正確體積的Master Mix變得困難。

根據(jù)ISO-8655，應(yīng)在移液前對(duì)移液器吸頭進(jìn)行預(yù)潤(rùn)洗，尤其是移取粘性液體時(shí)。對(duì)于粘性液體，預(yù)潤(rùn)洗的作用類似于反向移液技術(shù)中吸入的額外樣品體積，并對(duì)因粘性液體在移液過程中粘附在標(biāo)準(zhǔn)塑料移液器吸頭上而導(dǎo)致的樣品損失進(jìn)行補(bǔ)償。目前，研究人員可以選擇使用低吸附移液器吸頭，當(dāng)移取粘性液體時(shí)可大大減少滯留在移液器吸頭上的殘留樣品量。

在本應(yīng)用說明中，我們對(duì)Master Mix的移取進(jìn)行了以下測(cè)試：

• 正向移液與反向移液
• 移液器吸頭類型
• 預(yù)潤(rùn)洗
• 使用電動(dòng)移液器的優(yōu)勢(shì)

方法

移液技術(shù)
移液器是一種精密儀器，它與吸頭組合為一個(gè)系統(tǒng)來發(fā)揮作用。為避免因移液不當(dāng)而導(dǎo)致數(shù)據(jù)變化，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)堅(jiān)持使用正確的移液技術(shù)，即在移液器上使用同廠家（賽多利斯）的吸頭，以確保移液器和移液器吸頭之間的恰當(dāng)密封。在吸液過程中保持移液器垂直。吸液過程中，將吸頭浸入Master Mix中的深度保持在2mm，以避免吸入體積過多，并避免過多的Master Mix粘附在移液器吸頭外側(cè)。在排液過程中，移液器呈45度角，移液器吸頭接觸PCR管的內(nèi)側(cè)。正向移液和反向移液技術(shù)如圖1所示。
 
qPCR準(zhǔn)備
qPCR準(zhǔn)備階段使用賽多利斯移液器（Tacta® 手動(dòng)移液器和Picus® Nxt 電動(dòng)移液器）、賽多利斯SafetySpace濾芯吸頭及低吸附濾芯吸頭。使用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（不含ROX）、大腸桿菌uidA基因引物以及無核酸酶水來制備用于所有測(cè)試的PCR Master Mix儲(chǔ)備液。用移液器重復(fù)將八個(gè)15μL的Master Mix移取至PCR板孔中，用于各種測(cè)試條件。

無模板對(duì)照（NTC）樣品不含大腸桿菌基因組DNA，并加入了5μL無核酸酶水。用類似方法移取含有5μL大腸桿菌gDNA的系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（含有1×106，1×105，1×104，1×103 以及1×102個(gè)拷貝|反應(yīng)）。在每個(gè)測(cè)試孔中加入5μL含有1×103個(gè)拷貝/反應(yīng)的大腸桿菌gDNA。使用Picus® Nxt 電動(dòng)移液器的多次分液功能配合低吸附濾芯吸頭，以相同的方式將所有DNA樣本添加到PCR管中。使用LightCycler® 480 qPCR儀進(jìn)行qPCR分析。循環(huán)參數(shù)如下：在95℃下預(yù)培養(yǎng)10分鐘，隨后在95℃ 10秒、55℃ 10秒、75℃ 15秒，三步循環(huán)40次，最后在75℃下延伸10秒。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣品中的SYBR綠色熒光激發(fā)進(jìn)行定量。使用LightCycler® 480軟件確定定量循環(huán)定量循環(huán)（Cq）值和實(shí)際拷貝數(shù)，并使用MS Excel分析結(jié)果。

數(shù)據(jù)分析
移液過程中的系統(tǒng)誤差是準(zhǔn)確度的一種度量——它反映了所得結(jié)果與真實(shí)值的接近程度。Cq值的百分比系統(tǒng)誤差（%S）反映了處理Master Mix的儀器系統(tǒng)（移液器和吸頭系統(tǒng)）Cq值的誤差。移液過程中的隨機(jī)誤差是結(jié)果精確度的一種度量，反映了實(shí)驗(yàn)中重復(fù)樣品之間的差異。Cq值的百分比隨機(jī)誤差（%R）反映了結(jié)果的重現(xiàn)性，并且可能受到實(shí)驗(yàn)人員移液操作的影響。百分比不確定度的數(shù)值同時(shí)說明了結(jié)果的準(zhǔn)確度（百分比系統(tǒng)誤差）和精確度（百分比隨機(jī)誤差）。


結(jié)果

正向移液和反向移液
使用Tacta®手動(dòng)移液器、標(biāo)準(zhǔn)SafetySpace濾芯吸頭和低吸附濾芯吸頭，對(duì)使用正向移液與反向移液移取Master Mix進(jìn)行比較，并將正向移液預(yù)潤(rùn)洗與反向移液前的預(yù)潤(rùn)洗與否的結(jié)果進(jìn)行比較。

如圖2所示，使用低吸附濾芯吸頭搭配正向移液技術(shù)獲得了最佳的結(jié)果（Cq的百分比系統(tǒng)誤差=0.02，Cq的百分比隨機(jī)誤差=0.46，Cq的百分比不確定度=0.9）。第二好的方法是使用標(biāo)準(zhǔn)濾芯吸頭搭配反向移液技術(shù)（Cq的百分比系統(tǒng)誤差=0.22，Cq的百分比隨機(jī)誤差=0.50，Cq的百分比不確定度=1.2）。 圖2：Master Mix正向和反向移液的Cq（定量循環(huán)）百分比誤差。顯示了Cq（定量循環(huán)）的百分比系統(tǒng)誤差和Cq的百分比隨機(jī)誤差。對(duì)于每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，n=8。與反向移液相比，正向移液的系統(tǒng)誤差較低（灰色條）。標(biāo)準(zhǔn)吸頭為賽多利斯SafetySpace濾芯吸頭，低吸附吸頭為賽多利斯SafetySpace低吸附吸頭。

因此，使用低吸附移液器吸頭搭配正向移液技術(shù)或使用標(biāo)準(zhǔn)移液器吸頭搭配反向移液技術(shù)是準(zhǔn)確且精確地移取Master Mix的良好方法。這一結(jié)果還表明，低吸附移液器吸頭的低吸附性能消除了反向移液技術(shù)或預(yù)潤(rùn)洗技術(shù)中由于液體的粘稠性而需要額外的樣品去補(bǔ)償粘附在標(biāo)準(zhǔn)移液器吸頭上造成的損失。

移取Master Mix前對(duì)移液器吸頭進(jìn)行預(yù)潤(rùn)洗
預(yù)潤(rùn)洗能夠調(diào)節(jié)空氣置換式移液器的空氣柱，并用額外的樣品在移液器吸頭的內(nèi)側(cè)形成液體膜，以提高結(jié)果的重現(xiàn)性（精確度，百分比隨機(jī)誤差）。使用Tacta® 手動(dòng)移液器和標(biāo)準(zhǔn)SafetySpace濾芯吸頭，在移取Master Mix之前對(duì)移液器吸頭預(yù)潤(rùn)洗5次。如圖3所示，與ISO-8655一致，對(duì)于使用標(biāo)準(zhǔn)濾芯吸頭吸取Master Mix，與正向移液前不進(jìn)行預(yù)潤(rùn)洗（Cq的百分比隨機(jī)誤差=0.8）相比，正向移液前預(yù)潤(rùn)洗吸頭略微改善了結(jié)果的重現(xiàn)性（Cq的百分比隨機(jī)誤差=0.7）。然而，與使用正向移液搭配預(yù)潤(rùn)洗技術(shù)（Cq的百分比隨機(jī)誤差=0.7）相比，使用標(biāo)準(zhǔn)濾芯吸頭搭配反向移液技術(shù)具有更好的結(jié)果重現(xiàn)性（Cq的百分比隨機(jī)誤差=0.5）。與預(yù)期結(jié)果相同，與反向移液前不進(jìn)行預(yù)潤(rùn)洗（Cq的百分比隨機(jī)誤差=0.5）相比，反向移液前預(yù)潤(rùn)洗對(duì)結(jié)果的重現(xiàn)性沒有顯著影響（Cq的百分比隨機(jī)誤差=0.5），因此反向移液前無需預(yù)潤(rùn)洗標(biāo)準(zhǔn)濾芯吸頭。值得注意的是，與在正向移液前進(jìn)行預(yù)潤(rùn)洗（Cq的百分比隨機(jī)誤差=0.7）相比，使用低吸附濾芯吸頭搭配正向移液技術(shù)移取Master Mix具有更好的重現(xiàn)性（Cq的百分比隨機(jī)誤差=0.5）。
  圖3：（A）在移取Master Mix時(shí)，移液器吸頭預(yù)潤(rùn)洗和不潤(rùn)洗的Cq（定量循環(huán)）百分比誤差，顯示了Cq（定量循環(huán)）的百分比系統(tǒng)誤差和Cq的百分比隨機(jī)誤差。對(duì)于每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，n=8。(B）量化的大腸桿菌uidA拷貝數(shù)。黃線表示實(shí)際目標(biāo)數(shù)量。正向移液不潤(rùn)洗的系統(tǒng)誤差比預(yù)潤(rùn)洗更低。標(biāo)準(zhǔn)吸頭為賽多利斯SafetySpace濾芯吸頭

低吸附移液器吸頭及標(biāo)準(zhǔn)移液器吸頭
使用賽多利斯低吸附濾芯吸頭和SafetySpace濾芯吸頭搭配Tacta® 手動(dòng)移液器對(duì)適用于移取Master Mix的移液器吸頭類型進(jìn)行了測(cè)試。如圖4所示，使用正向移液技術(shù)時(shí)，與搭配標(biāo)準(zhǔn)濾芯吸頭（Cq百分比隨機(jī)誤差=0.8，Cq百分比系統(tǒng)誤差=-0.03，百分比不確定度=1.6）相比，搭配低吸附濾芯吸頭的重現(xiàn)性更好，且Cq值的不確定度更低（Cq百分比隨機(jī)誤差=0.5，Cq百分比系統(tǒng)誤差=0.02，百分比不確定度=0.9）。這一結(jié)果表明，低吸附吸頭最適合用于處理PCR Master Mix。
電動(dòng)移液器
使用賽多利斯Picus® Nxt電動(dòng)移液器、賽多利斯Tacta®手動(dòng)移液器搭配低吸附濾芯吸頭，對(duì)移取Master Mix進(jìn)行了對(duì)比測(cè)試。電動(dòng)移液器使用了多次分液模式，手動(dòng)移液器采用正向移液技術(shù)。如圖5所示，當(dāng)使用低吸附濾芯吸頭移取Master Mix時(shí)，采用電動(dòng)移液器的多次分液模式所得結(jié)果為：Cq=24.54±0.09，Cq的百分比系統(tǒng)誤差=0.12，Cq的百分比隨機(jī)誤差=0.4，Cq的百分比不確定度=0.9；相比之下，采用手動(dòng)移液器的正向移液所得結(jié)果為：Cq=24.52±0.11，Cq的百分比系統(tǒng)誤差=0.02，Cq的百分比隨機(jī)誤差=0.5，Cq的百分比不確定度=0.9。使用電動(dòng)移液器得到的結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性（百分比隨機(jī)誤差），且其Cq值的總體百分比不確定度與手動(dòng)移液器相當(dāng)，都處于較低水平。電動(dòng)移液器的多次分液模式可確保一次吸液，即可將Master Mix按順序分配到所有八個(gè)重復(fù)孔中，顯著提高了移液速度，并減少移液器吸頭的使用數(shù)量，更環(huán)保的同時(shí)也減少了不同吸頭之間的差異。
  圖5：（A）使用電動(dòng)或手動(dòng)移液器移取Master Mix時(shí)的誤差百分比。顯示了Cq的百分比隨機(jī)誤差和Cq的百分比不確定度（百分比隨機(jī)誤差和百分比系統(tǒng)誤差）。手動(dòng)移液器采用正向移液技術(shù)，電動(dòng)移液器采用多次分液模式。(B）量化的大腸桿菌uidA拷貝數(shù)。黃線表示實(shí)際目標(biāo)數(shù)量。對(duì)于每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，n=8。低吸附吸頭為賽多利斯SafetySpace低吸附吸頭。

討論

移液是PCR檢測(cè)的基礎(chǔ)。本研究證明了最佳技術(shù)搭配是使用正向移液技術(shù)搭配低吸附濾芯吸頭，而標(biāo)準(zhǔn)移液器吸頭移搭配反向移液技術(shù)可提供次佳的結(jié)果重現(xiàn)性（精密度）。還證明了電動(dòng)移液器能夠確保較高的準(zhǔn)確度和精密度，并加快完成分析的速度，減少移液所需的時(shí)間，使操作更符合人體工程學(xué)。因此，它可以降低實(shí)驗(yàn)室工作人員患上重復(fù)性勞損（RSI）的可能性，并使實(shí)驗(yàn)更不容易出錯(cuò)；此外，它還能在相同的實(shí)驗(yàn)中使用更少的移液器吸頭，因此也是更環(huán)保的選擇。

 

本研究結(jié)果特別適用于需要報(bào)告分析的CV%和Z因子，以便為最終用戶提供最佳規(guī)格的分析開發(fā)、診斷和質(zhì)量控制人員。這些指南對(duì)于執(zhí)行定量分析的個(gè)人也很重要，例如確定腸道微生物群特征，其中細(xì)菌的定性和定量可通過qPCR分析進(jìn)行，或在研發(fā)過程中測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞培養(yǎng)基成分中的細(xì)菌污染，或用于合規(guī)性測(cè)試，例如根據(jù)EP/USP/JP 使用qPCR試劑盒進(jìn)行測(cè)試，如賽多利斯Microsart® 研究細(xì)菌試劑盒。
 

Microsart®