人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞的應(yīng)用！

 一、背景

NCI-H460人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞是從一位大細(xì)胞肺癌患者的胸水中建立的。NCI-H460細(xì)胞表達(dá)的p53 mRNA易于檢測，水平與正常肺細(xì)胞相當(dāng)，未表現(xiàn)出NCI-H460細(xì)胞DNA總體結(jié)構(gòu)異常。NCI-H460細(xì)胞角蛋白和波形蛋白纖維染色陽性；神經(jīng)絲三聯(lián)體蛋白陰性。

二、培養(yǎng)步驟

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。棄培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入到凍存液中。

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

三、應(yīng)用

用于尼古丁對NCI-H1975和NCI-H460細(xì)胞促進(jìn)增殖作用及對PI3K/Akt通路的影響研究：

探討尼古丁對不同病理來源NSCLCs作用差異和可能機制,為建立尋找針對不同病理類型NSCLCs治療提供理論依據(jù)。方法:分別利用CCK-8細(xì)胞毒性試劑盒及流式細(xì)胞術(shù)檢測尼古丁對人肺腺癌細(xì)胞NCI-H1975和人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460的促進(jìn)增殖和抑制凋亡作用。利用Western blot和RT-PCR技術(shù)檢測尼古丁作用后NCI-H1975和NCI-H460細(xì)胞PI3K/Akt通路關(guān)鍵基因m RNA及蛋白表達(dá)的改變,建立尼古丁對不同病理類型NSCLCs細(xì)胞作用產(chǎn)生差異的分子機制。

結(jié)果：

1、CCK-8檢測結(jié)果顯示尼古丁對NCI-H1975、NCI-H460細(xì)胞均有促進(jìn)增殖的作用,與對照組具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）,具有時間依賴性（NCI-H1975,y=102.5e0.056x,R2=0.982;NCI-H460,y=102.5e0.056x,R2=0.976）及劑量依賴性（NCI-H1975,y=11.72ln（X）+100.4,R2=0.994;NCI-H460,y=10.90ln（x）+99.68,R2=0.996）,但NCI-H1975對尼古丁反應(yīng)更迅速,更敏感,變化更大。

2、流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示尼古丁能顯著降低順鉑導(dǎo)致的NCI-H1975、NCI-H460細(xì)胞凋亡（P<0.05）,具有時間依賴性（NCI-H1975,y=66.48x0.84,R2=0.979;NCI-H460,y=63.98x0.84,R2=0.985）,但NCI-H1975對尼古丁反應(yīng)更迅速,更敏感,變化更大。

3、Western blot及RT-PCR檢測結(jié)果顯示尼古丁干預(yù)后隨尼古丁濃度增大NCI-H1975細(xì)胞PI3K m RNA表達(dá)增加、Bad/Caspase 9/Fox O3a/m TOR m RNA表達(dá)下降,隨尼古丁濃度增大NCI-H1975細(xì)胞PI3K/p-Akt/p-Bad/p-Caspase9/p-Fox O3a/p-m TOR蛋白表達(dá)增加、Bad/Fox O3a/m TOR表達(dá)下降;隨尼古丁作用時間增加NCI-H1975細(xì)胞PI3K m RNA表達(dá)增加、Bad/Fox O3a/m TOR m RNA表達(dá)下降,隨尼古丁作用時間增加NCI-H1975細(xì)胞PI3K蛋白表達(dá)增加、Bad/Caspase9/Fox O3a/m TOR表達(dá)下降。尼古丁干預(yù)后隨尼古丁濃度增大NCI-H460細(xì)胞PI3K m RNA表達(dá)增加、Bad/Fox O3a/m TOR m RNA表達(dá)下降,隨尼古丁濃度增大NCI-H460細(xì)胞PI3K/p-Akt/p-Bad/p-m TOR蛋白表達(dá)增加、Bad/Fox O3a/m TOR表達(dá)下降;隨尼古丁作用時間增加NCI-H460細(xì)胞PI3K m RNA表達(dá)增加、Bad/Fox O3a/m TOR m RNA表達(dá)下降,隨尼古丁作用時間增加NCI-H460細(xì)胞PI3K蛋白表達(dá)增加、Bad/Fox O3a/m TOR表達(dá)下降。

4、尼古丁對NCI-H1975、NCI-H460細(xì)胞Caspase 9和Fox O3a兩蛋白作用出現(xiàn)差異。

結(jié)論：

1、尼古丁對NCI-H1975、NCI-H460細(xì)胞有促進(jìn)增殖和抑制凋亡作用,且作用具有劑量依賴性和時間依賴性。

2、NCI-H1975和NCI-H460細(xì)胞對尼古丁反應(yīng)不同。

3、尼古丁可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路下游Bad、Caspase 9、Fox O3a、m TOR基因表達(dá)水平及磷酸化水平來調(diào)節(jié)NCI-H1975和NCI-H460細(xì)胞增殖與凋亡。