質(zhì)粒的提取和純化

 　　 質(zhì)粒（Plasmid）是獨立于染色體外的環(huán)狀DNA分子，大小通常在1-200Kb不等，可依賴宿主細(xì)胞中的酶和蛋白質(zhì)進(jìn)行獨立地復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。

　　  質(zhì)粒是獨立于染色體基因組的DNA。按照質(zhì)粒的拷貝數(shù)量，通常把質(zhì)粒分嚴(yán)緊型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒：染色體復(fù)制一次，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個細(xì)菌內(nèi)只含1-2個質(zhì)粒；松弛型質(zhì)粒：當(dāng)細(xì)菌染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個細(xì)菌內(nèi)一般含20個左右質(zhì)粒拷貝。

　　  為了適應(yīng)更多復(fù)雜的分子克隆實驗，在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，人們構(gòu)建出具有不同特性的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體通常具有以下幾個特點：具有較小的分子量、可插入較大分子量的目標(biāo)序列、具有多種常用的限制性內(nèi)切酶酶切位點，同時具有檢測表型（耐藥性等）。

　　  典型的質(zhì)粒載體通常具有復(fù)制起始點Ori（下方藍(lán)色方形）、篩選標(biāo)記（紅色區(qū)域）以及多克隆酶切位點MCS（右側(cè)藍(lán)色區(qū)域）

　　  預(yù)備知識Ⅱ：分離純化的原理

　　  質(zhì)粒純化的過程實際上是將質(zhì)粒與染色體基因組、蛋白質(zhì)等其他成分分離的過程。在細(xì)菌體內(nèi)，質(zhì)粒是以共價閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)的形式存在。堿裂解法是實驗室提取質(zhì)粒最常用的方法之一，該方法的原理是利用線性的染色體DNA與閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來實現(xiàn)分離。

　　  共價閉合環(huán)狀DNA(CovalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)結(jié)構(gòu)示意圖，在細(xì)菌中，cccDNA通常以超螺旋的形式存在

　　  實驗操作中，我們通常應(yīng)用溶菌酶和陰離子表面按活性劑SDS（十二烷基磺酸鈉）來處理收集到的菌體。在溶菌酶的作用下，細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂并釋放出質(zhì)粒。在pH12-12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性染色體DNA的雙螺旋會解開，質(zhì)粒DNA的氫鍵也會斷裂。然而，質(zhì)粒DNA的氫鍵雖然斷裂，但兩條鏈依然互補纏繞，緊密結(jié)合。在裂解過程中，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物，SDS可包被在這些大型復(fù)合物表面上。當(dāng)加入乙酸甲使溶液恢復(fù)中性時，兩種DNA均可迅速復(fù)性，但是復(fù)性的精準(zhǔn)度有所差別：cccDNA由于互補鏈在形體上始終保持在一起，復(fù)性迅速而準(zhǔn)確。隨機斷裂的線性DNA彼此分離，復(fù)性既不迅速也不準(zhǔn)確，會聚集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA會與細(xì)胞碎片一起被沉淀下來，而質(zhì)粒DNA會留在上清液中。再用異丙醇或乙醇洗滌，會得到比較純的質(zhì)粒DNA。

　　  質(zhì)粒提取與純化操作指南

　　  質(zhì)粒的提取和純化主要包含三個步驟：①培養(yǎng)細(xì)菌，擴增質(zhì)粒；②收集并裂解細(xì)菌；③分離并純化質(zhì)粒。目前，試劑廠商已經(jīng)開發(fā)出多種多樣的商品化DNA提取試劑盒，這些試劑盒中幾乎都包含三種基本的溶液：溶液Ⅰ（葡萄糖、Tris·Cl(pH8.0)、EDTA(pH8.0)）、溶液Ⅱ（NaOH，1%SDS）和溶液Ⅲ這三種溶液分別起到懸浮菌體、破碎細(xì)胞以及中和的作用。實驗中一般會使用異丙醇沉淀質(zhì)粒，70%的乙醇洗滌質(zhì)粒。提取好的質(zhì)粒的可以保存在含有RNA酶的TE緩沖液中。