質(zhì)粒擴(kuò)增的操作步驟和抽提過程中的注意事項(xiàng)

 一、擴(kuò)增流程
         收到產(chǎn)品后，請(qǐng)先根據(jù)產(chǎn)品管壁標(biāo)簽來判斷產(chǎn)品形式，并在擴(kuò)增前準(zhǔn)確查找該質(zhì)粒菌株的抗性、感受態(tài)和培養(yǎng)溫度。
        1、質(zhì)粒干粉（常溫運(yùn)輸，存于-20度，90天保質(zhì)期，請(qǐng)務(wù)必轉(zhuǎn)化挑單克隆培養(yǎng)）
        ①收到質(zhì)粒干粉后請(qǐng)先5000rpm離心1min，再加入20μl ddH2O去離子水溶解質(zhì)粒；
        ②取1支100μl 感受態(tài)于冰上解凍10min，加入2μl質(zhì)粒，再冰浴30min后，42℃熱激60s，不要攪動(dòng)，再冰浴2min；
（從第二步開始均要在超凈工作臺(tái)中無菌操作）
        ③加入900μl無抗的LB液體培養(yǎng)基，180rpm震蕩37℃培養(yǎng)45min；
        ④6000rpm離心5min，僅留100μl上清液重懸細(xì)菌沉淀，并涂布至目標(biāo)質(zhì)粒抗性的LB平板上；
（可使用本平臺(tái)的平板涂布專用玻璃珠進(jìn)行涂布，可以比傳統(tǒng)涂布方法獲得更多轉(zhuǎn)化子）
        ⑤將平板正向培養(yǎng)1h，再倒置37℃培養(yǎng)14h。如果要求是30度則培養(yǎng)20h；
（如果菌落過多，請(qǐng)將質(zhì)粒稀釋后再轉(zhuǎn)化。如果無菌落，請(qǐng)加入10μl質(zhì)粒離心全涂轉(zhuǎn)化）
        ⑥挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，加入對(duì)應(yīng)抗生素，220rpm震蕩培養(yǎng)14h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。
        2、甘油菌種（冰袋運(yùn)輸，存于-80℃，保質(zhì)期30天，請(qǐng)務(wù)必劃線挑單克隆培養(yǎng)）
四區(qū)劃線后挑單菌落培養(yǎng)，酵母菌需要先液體復(fù)蘇再四區(qū)劃線，再挑單菌落液體培養(yǎng)。
        3、穿刺菌種（冰袋運(yùn)輸，存于4℃，保質(zhì)期7天）
穿刺接種，液體培養(yǎng)后四區(qū)劃線，再挑單菌落液體培養(yǎng)。
        4、菌落平板（冰袋運(yùn)輸，存于4℃，保質(zhì)期7天）
直接挑取單菌落至液體培養(yǎng)基中。
        5、液體質(zhì)粒（冰袋運(yùn)輸，存于-20℃，保質(zhì)期30天）
單獨(dú)提取的液體質(zhì)粒收到后可直接使用。
如需要大題好的質(zhì)粒，可以下單備注。

降低RNA殘留的方法

   RNA 的去除，首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高濃度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的質(zhì)粒，都可以降低 RNA 殘留，但都不能徹底去除。幸運(yùn)的是，RNA 的殘留并不影響酶切等最常用的用途。如果想徹底去除 RNA 殘留，可以用試劑盒，或者使用對(duì) 4 個(gè)堿基都作用的 RNase。 

降低gDNA殘留的方法

   gDNA 的殘留問題，必須在抽提過程中解決，否則，就只能用膠回收方法處理了。gDNA 越大，越難于復(fù)性，也就越容易被去除；所以，一定要盡可能不打斷 gDNA。裂解體系越粘稠，gDNA 越容易被扯斷；操作手法越重，gDNA 也越容易被打斷。溫和操作，使用相對(duì)過剩的試劑，是降低 gDNA 殘留的最好方法。

降低蛋白質(zhì)殘留的方法

   蛋白質(zhì)的去除，主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。雖然將中和后的體系置于 4C 一段時(shí)間，可以形成更多的該不溶復(fù)合物，從而使蛋白質(zhì)殘留更少，但實(shí)踐證明這樣做并不是必須的，除非是大量抽提。只要加入溶液 I 后的懸浮，加入溶液 II 后的裂解及加入溶液 III 后的中和是均勻徹底的，蛋白質(zhì)的殘留就應(yīng)該在可以滿足實(shí)驗(yàn)要求的水平；而只有溶液的用量足夠，甚至過剩，才能確保裂解和中和是徹底的。當(dāng)然，試劑盒等的使用，是可以更進(jìn)一步降低蛋白質(zhì)的殘留的。

降低質(zhì)粒Nick的方法

   細(xì)菌收獲時(shí)間，菌株的選擇，抽提操作的劇烈程度是影響 Nick 的三個(gè)主要因素。細(xì)菌收獲過早，質(zhì)粒還在復(fù)制過程中，Nick 的比例較高；過晚，細(xì)菌開始死亡，雜質(zhì)會(huì)比較多。如果使用胞內(nèi)酶含量很高的宿主菌，會(huì)出現(xiàn)較高比例的 Nick。加入溶液 II 及加入溶液 III 的混勻操作，也可以導(dǎo)致一些 Nick，但影響不會(huì)比前兩者大。

降低變性超螺旋的方法

   理論上，用堿裂解法抽提質(zhì)粒，變性超螺旋的出現(xiàn)是不可避免的。  之所以大家沒有非常在意，一是因?yàn)樗�的存在似乎�?duì)酶反應(yīng)沒有任何影響，二是因?yàn)樗�的含量并不一定高到被用電泳觀察到。抽提使用相對(duì)過剩的溶液，在加入溶液 II 后，體系能在 1 分鐘內(nèi)變澄清，再快速加入溶液 III，這樣基本上能將變性超螺旋的出現(xiàn)控制在電泳看不見的水平。 (變性超螺旋電泳時(shí)比正常超螺旋跑得快一點(diǎn)點(diǎn)。)

關(guān)于質(zhì)粒多聚體

   QIAGEN 提供了一個(gè)沒有進(jìn)一步解釋的觀察：從有些宿主菌中抽提質(zhì)粒 (pTZ19)，電泳能發(fā)現(xiàn)很多條帶；但使用單酶切后，仍然變成一條帶，大小正好是線性單質(zhì)粒的大小。根據(jù)這一觀察，可以推理如下：那些大的條帶(質(zhì)粒多聚體)是由完整的單質(zhì)粒“粘”在一起形成的，而不是我的一條鏈與你的一條鏈復(fù)性在一起；第二，這種“粘”只是部分的，否則酶切會(huì)有問題；第三，這種“粘”是脆弱的，線性后的剛性足以打破它。如果是這樣，質(zhì)粒多聚體的出現(xiàn)與質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)及序列有關(guān)，可以不管它(也管不了)，因?yàn)樗�不影響酶切，或者說，即使質(zhì)粒多聚體切不動(dòng)，也不會(huì)影響太大�？傊�，碰到這種情況，不要簡單地認(rèn)為有問題，而是應(yīng)該一步一步往下做，但一定要做完一步，檢測(cè)一次，看一看結(jié)果與預(yù)期的吻合程度。

提高得率的方法

   利用氯霉素抑制染色體的復(fù)制，而不抑制質(zhì)粒的復(fù)制這一特點(diǎn)，在低拷貝質(zhì)粒（如pUC19）的培養(yǎng)過程中添加氯霉素可以大大提高得率。