人膽囊癌細胞的培養(yǎng)和應用
一、背景
人膽囊癌細胞是從一位61歲的男性低分化膽囊癌患者中建立的；GBC-SD細胞的形狀有多邊形、紡錘形和正方形；GBC-SD細胞能分泌CEA和CA19-9。GBC-SD細胞倍增時間大約為21.4小時，可移植到裸鼠，生成的腫瘤與原發(fā)腫瘤相似。
二、細胞培養(yǎng)步驟
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。
2、細胞處理：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在800-1000RPM條件下離心4-5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，補加培養(yǎng)基至6ml。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml此細胞的培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.收到細胞后首次傳代將細胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用，后續(xù)傳代根據實際情況按1:2到1:4的比例進行。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
三、應用
用于青蒿琥酯聯合5-氟尿嘧啶對人膽囊癌細胞作用的實驗研究：
研究青蒿琥酯和5-FU對人膽囊癌細胞的增殖、遷移、凋亡和細胞周期的影響,比較兩種藥物對細胞的作用強度,探究青蒿琥酯在治療膽囊癌中的應用前景。
方法：用CCK-8法來檢測青蒿琥酯和5-FU的OD值并計算半數抑制濃度（IC50）值;使用EdU-488法和克隆形成實驗用來測定青蒿琥酯和5-FU對細胞增殖的影響;細胞劃痕實驗用來測定青蒿琥酯和5-FU單用和聯用對細胞遷移的影響;使用AnnexinV和PI雙標法標記細胞,使用流式細胞儀用來測定青蒿琥酯和5-FU單用和聯用誘導細胞凋亡發(fā)生的情況;使用PI單標法標記細胞,使用流式細胞儀來測定青蒿琥酯和5-FU單用和聯用對細胞周期的影響情況。
結果：CCK-8法顯示選取48h的OD值數據計算得出的結果作為青蒿琥酯的IC50值,IC50=43.7μmol/L,5-FU的IC50=28.1μmol/L。在24h和48h觀察時間點內,與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組對細胞的增殖能力有抑制作用。EdU-488法顯示與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯合作用組對細胞的增殖有抑制作用。細胞劃痕的結果顯示與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯合組對細胞的遷移能力有抑制作用。
AnnexinV和PI雙標法檢測5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯合組誘導細胞凋亡的能力顯示與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯合組對細胞的凋亡發(fā)生有明顯促進作用。PI單標法用來檢測細胞的細胞周期,5-FU組、青蒿琥酯組以及在兩藥聯合作用組時顯示與對照組相比,5-FU組、青蒿琥酯組以及兩藥聯合組能抑制細胞的S期和G2/M期。
結論：1、青蒿琥酯在體外可抑制GBC-SD膽囊癌細胞的增殖、凋亡;2、在體外實驗中,青蒿琥酯和5-FU聯用較青蒿琥酯單用抗腫瘤的效果更好;3、在體外實驗中,青蒿琥酯和5-FU聯用較5-FU單用抗腫瘤的效果更好;4、在體外實驗中,青蒿琥酯抗腫瘤的效果弱于5-FU抗腫瘤的效果。
人膽囊癌細胞是從一位61歲的男性低分化膽囊癌患者中建立的；GBC-SD細胞的形狀有多邊形、紡錘形和正方形；GBC-SD細胞能分泌CEA和CA19-9。GBC-SD細胞倍增時間大約為21.4小時，可移植到裸鼠，生成的腫瘤與原發(fā)腫瘤相似。
二、細胞培養(yǎng)步驟
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。
2、細胞處理：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在800-1000RPM條件下離心4-5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，補加培養(yǎng)基至6ml。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml此細胞的培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.收到細胞后首次傳代將細胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議凍存一支備用，后續(xù)傳代根據實際情況按1:2到1:4的比例進行。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
三、應用
用于青蒿琥酯聯合5-氟尿嘧啶對人膽囊癌細胞作用的實驗研究：
研究青蒿琥酯和5-FU對人膽囊癌細胞的增殖、遷移、凋亡和細胞周期的影響,比較兩種藥物對細胞的作用強度,探究青蒿琥酯在治療膽囊癌中的應用前景。
方法：用CCK-8法來檢測青蒿琥酯和5-FU的OD值并計算半數抑制濃度（IC50）值;使用EdU-488法和克隆形成實驗用來測定青蒿琥酯和5-FU對細胞增殖的影響;細胞劃痕實驗用來測定青蒿琥酯和5-FU單用和聯用對細胞遷移的影響;使用AnnexinV和PI雙標法標記細胞,使用流式細胞儀用來測定青蒿琥酯和5-FU單用和聯用誘導細胞凋亡發(fā)生的情況;使用PI單標法標記細胞,使用流式細胞儀來測定青蒿琥酯和5-FU單用和聯用對細胞周期的影響情況。
結果：CCK-8法顯示選取48h的OD值數據計算得出的結果作為青蒿琥酯的IC50值,IC50=43.7μmol/L,5-FU的IC50=28.1μmol/L。在24h和48h觀察時間點內,與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組對細胞的增殖能力有抑制作用。EdU-488法顯示與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯合作用組對細胞的增殖有抑制作用。細胞劃痕的結果顯示與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯合組對細胞的遷移能力有抑制作用。
AnnexinV和PI雙標法檢測5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯合組誘導細胞凋亡的能力顯示與對照組相比,5-FU組和青蒿琥酯組以及兩藥聯合組對細胞的凋亡發(fā)生有明顯促進作用。PI單標法用來檢測細胞的細胞周期,5-FU組、青蒿琥酯組以及在兩藥聯合作用組時顯示與對照組相比,5-FU組、青蒿琥酯組以及兩藥聯合組能抑制細胞的S期和G2/M期。
結論：1、青蒿琥酯在體外可抑制GBC-SD膽囊癌細胞的增殖、凋亡;2、在體外實驗中,青蒿琥酯和5-FU聯用較青蒿琥酯單用抗腫瘤的效果更好;3、在體外實驗中,青蒿琥酯和5-FU聯用較5-FU單用抗腫瘤的效果更好;4、在體外實驗中,青蒿琥酯抗腫瘤的效果弱于5-FU抗腫瘤的效果。
