在NIR-II窗口通過分子改造同步提高胰腺癌治療的I型光動(dòng)力和光熱效率

本文要點(diǎn)：胰腺癌是最具侵襲性和致命性的惡性腫瘤之一，然而常規(guī)光療材料具有穿透深度較低、對氧的依賴性強(qiáng)、對熱休克蛋白抑制作用高的缺點(diǎn)，制約了整體治療效果。在這項(xiàng)研究中，作者設(shè)計(jì)了一種具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射(AIE)特征的光敏劑DCTBT，該光敏劑具有近紅外二區(qū)熒光成像(NIR-II FLI)、I型光動(dòng)力療法(type-I PDT)和光熱療法(PTT)的功能。在EGFR靶向多肽修飾的兩親性聚合物的輔助下，制備的DCTBT脂質(zhì)體能夠有效地在胰腺腫瘤部位蓄積和可視化，并顯著抑制PANC-1皮下和原位腫瘤模型的腫瘤生長。
 

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方案1. 分子設(shè)計(jì)示意圖及其在NIR-II-FLI引導(dǎo)的I型PDT-PTT協(xié)同胰腺癌治療中的應(yīng)用

 

首先對分子進(jìn)行設(shè)計(jì)，DCTBT是在CTBT的基礎(chǔ)上在咔唑中引入二苯胺片段。二苯胺片段可以促進(jìn)分子內(nèi)較強(qiáng)的D-A相互作用，實(shí)現(xiàn)較低的帶隙和吸收、發(fā)射波長的紅移。另外，較強(qiáng)的D-A相互作用可以進(jìn)一步分離HOMO和LUMO之間的分布，獲得較小的單重態(tài)-三重態(tài)能隙，促進(jìn)I型ROS的產(chǎn)生。此外，二苯胺片段可以作為自由旋轉(zhuǎn)的分子旋轉(zhuǎn)體，消耗激發(fā)態(tài)能量，顯著降低分子間的π-π相互作用，提高DCTBT的AIE表征。
 

圖1. A)CTBT和DCTBT在CHCl3中的歸一化吸收光譜 B)DCTBT在不同含水率(fw)的THF/水混合物中的熒光光譜 C)相對發(fā)射強(qiáng)度(I/I0)與含水率的關(guān)系圖，I0和I分別是這兩個(gè)分子在THF和THF/水混合物中的熒光強(qiáng)度峰值 D)CTBT和DCTBT的粒度分布 E)CTBT和DCTBT的透射電子顯微鏡圖像 F)CTBT（左側(cè)）和DCTBT（右側(cè)）在水溶液中的歸一化吸收光譜 G)兩種NPs在水溶液中的歸一化發(fā)射光譜 H)兩種NPs和ICG的光穩(wěn)定性 I)兩種NPs和IR-26(QY=0.5% 在二氯乙烷中)在五種不同濃度下的積分熒光光譜(900-1500nm)的曲線圖

 

接著進(jìn)一步探索CTBT和DCTBT在聚集態(tài)的熒光性質(zhì)。如圖1B-1C所示，水含量從0%到90%，CTBT熒光強(qiáng)度都是低于溶液狀態(tài)的熒光強(qiáng)度。而水含量為90%的DCTBT的熒光強(qiáng)度比溶液狀態(tài)提高了5.9倍，表明DCBTB具有AIE特征。推測是由于DCBTB中二苯胺片段使DCBTB具有豐富的分子旋轉(zhuǎn)和較大的扭曲構(gòu)型，抑制了有害的分子間相互作用。為了驗(yàn)證這樣推測，估算這兩個(gè)NPs的扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)性質(zhì)，結(jié)果表明DCTBT具有高度的激發(fā)態(tài)和更強(qiáng)的TICT性質(zhì)，驗(yàn)證了上述推測。

 

為了在形態(tài)水平上進(jìn)一步解釋CTBT和DCTBT的光物理性質(zhì)，以兩親共聚物DSPE-PEG2000為包覆基質(zhì)，將CTBT和DCTBT組裝成納米粒子。制備的NPs具有良好的水分散性，呈球形，直徑分別為67nm和100nm左右（圖1D-1E），具有良好的的光穩(wěn)定性（圖1H），DCTBT NPs具有近紅外二區(qū)發(fā)射（1F-1G），以IR-26(QY=0.5%)為參照，CTBT NPs和DCTBT NPs水溶液的量子產(chǎn)率分別為16.92%和4.37%（圖1I）。這兩個(gè)NPs具有NIR-II發(fā)射特性和高熒光效率，是生物應(yīng)用的理想候選者。

 

圖2. 在CTBT或DCTBT NPs存在下A)DCFH(整體ROS檢測)、B)DHR123(O2·-檢測)和C)HPF(·OH檢測)在不同時(shí)間激光照射下的熒光強(qiáng)度的相對變化D)在CTBT或DCTBT NPs存在下，ABDA(1O2檢測)在不同時(shí)間激光照射下的分解率E)相同摩爾濃度的CTBT和DCTBTNPs在808nm（0.8W cm-2）激光照射5min冷卻至室溫下的光熱曲線 F）DCTBTNPs在808nm（0.8W cm-2）激光照射6min的光熱性能與濃度的關(guān)系

 

接下來先用DCFH-DA來評價(jià)總的ROS產(chǎn)生（圖2A）,接著用不同探針檢測ROS的種類，先用DHR123和HPF來檢測是否通過I類路徑產(chǎn)生·OH和O2·-（圖2B-2C），接著用ABDA來檢測是否通過II類路徑產(chǎn)生的1O2（圖2D），這些結(jié)果表明兩個(gè)NPs都具有產(chǎn)生ROS的能力，但是II路徑產(chǎn)生的ROS被抑制，可以通過I路徑產(chǎn)生·OH和O2·- 。

 

進(jìn)一步評價(jià)兩個(gè)NPs的光熱性能。如圖2E所示，CTBT NPs和DCTBT NPs水分散體的最高溫度分別達(dá)到55.7℃和62.8℃，結(jié)合光熱轉(zhuǎn)換率，得到DCTBT NPs比CTBT NPs具有更優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)化性能的結(jié)論，推斷可能是DCTBT中二苯胺使DCTBT的構(gòu)象更加扭曲，導(dǎo)致更有效的非輻射衰減過程。DCTBT NPs表現(xiàn)出濃度依賴的溫度升高（圖2F），驗(yàn)證了上述推測。
 

圖3. A)用DCFH、DHE、AFP和SOSG分別作為總ROS、O2·-、·OH和1O2熒光指示劑檢測PANC-1細(xì)胞中的ROS，比例尺：100μm B)不同濃度的lip-DCTBT NPs與PANC-1細(xì)胞孵育后，在無或者有激光（808nm，0.8W cm-2）照射下的細(xì)胞活力 C）經(jīng)lip-DCTBT NPs處理后的PANC-1細(xì)胞的活/死細(xì)胞染色。綠色和紅色分別代表活細(xì)胞和死亡細(xì)胞，比例尺：200μm

 

接著以卵磷脂、膽固醇和DSPE-mPEG2000為包封劑，制備疏水性DCTBT脂質(zhì)體（Non-Target-NPs），再用DSPE-PEG2000-GE11修飾脂質(zhì)體表面制備具有癌細(xì)胞靶向性的NPs（Target-NPs）。lip-DCTBT NPs具有較高的水溶性，呈球形，平均粒徑為80nm（Cryo-TEM）和121nm（DLS）。Target-NPs和Non-Target-NPsZETA電位分別為-20.3mV和-24.3mV。

 

進(jìn)一步研究lip-DCTBT NPs在PANC-1癌細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。如圖3A所示，有l(wèi)ip-DCTBTNPs加激光照射后，DCFH-DA、DHE和APF三種探針都呈現(xiàn)出明亮的綠色或紅色熒光，而對照組幾乎沒有觀察到明顯的熒光信號，值得注意的是，Target-NPs的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于Non-Target-NPs，這表明lip-DCTBT NPs能有效地在PANC-1癌細(xì)胞中通過I類途徑產(chǎn)生O2·-和·OH，而且腫瘤靶向配體可以促進(jìn)NPs在癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)和積聚。

 

用CCK-8比色法評價(jià)對PANC-1癌細(xì)胞的體外協(xié)同光治療的效果。如圖3B所示，表明Target-NPs和Non-Target-NPs對PANC-1癌細(xì)胞的毒性作用具有劑量依賴性。接著用活/死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證這兩種NPs對PANC-1癌細(xì)胞的治療效果，如圖3C所示，表明，lip-DCTBT NPs對PANC-1癌細(xì)胞有毒性作用，其中Target-NPs光療效果比Non-Target-NPs好。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，證明了Target-NPs對PANC-1癌細(xì)胞具有良好的光消融能力。
 

圖4. A)靜脈注射lip-DCTBTNPs后不同監(jiān)測時(shí)間的PANC-1荷瘤小鼠皮下NIR-II熒光圖像，a：Non-Target-NPs，b：Target-NPs B)熱成像，注射lip-DCTBT NPs后8小時(shí)，荷瘤小鼠在連續(xù)808 nm激光照射下（腫瘤部位）的加熱溫度 C)各治療組的相對腫瘤體積變化，**P < 0.01, ***P <0.001 D)不同治療后第17天采集的腫瘤圖像，比例尺：1cmE)第17天記錄各組平均瘤重，**P<0.01 F)不同治療方法腫瘤組織的H&E、Ki67和TUNEL染色分析，比例尺：200μm

 

緊接基于良好的體外光療性能，作者對PANC-1腫瘤進(jìn)行了體內(nèi)評估。在體內(nèi)對lip-DCTBT NPs進(jìn)行NIR-II FLI，如圖4A所示，lip-DCTBT NPs在注射48h后腫瘤部位的熒光信號仍然很強(qiáng)，并且Target-NPs組比起Non-Target-NPs組在腫瘤部位呈現(xiàn)出更明亮的熒光成像，這表明lip-DCTBTNPs在腫瘤部位中具有長期NIR-II熒光示蹤的潛力，引入的EGFR配體使lip-DCTBT NPs的腫瘤靶向能力增強(qiáng)。

 

為了進(jìn)一步驗(yàn)證lip-DCTBT NPs的光熱治療潛力，在皮下PANC-1腫瘤小鼠上進(jìn)行了體內(nèi)光熱評估。如圖4B所示，Target-NPs處理的小鼠腫瘤區(qū)域的溫度在1min內(nèi)從32.9℃迅速上升到59.6℃，在5分鐘內(nèi)達(dá)到63℃左右的平臺值，并且表現(xiàn)出更高的溫度升高，這顯示出lip-DCTBT NPs在PTT應(yīng)用的巨大潛力。

 

在皮下腫瘤模型上評價(jià)lip-DCTBT NPs的光療效果，將PANC-1荷瘤BALB/c裸鼠隨機(jī)分為5組（PBS；PBS+laser；Target-NPs；Non-Target-NPs+laser；Target-NPs+laser）。如圖4C所示，對照組(PBS；PBS+laser；Target-NPs)的腫瘤體積持續(xù)增大，相比之下，實(shí)驗(yàn)組（Non-Target-NPs+laser；Target-NPs+laser）的腫瘤生長得到明顯抑制，并且Target-NPs+laser的抑瘤率（87.5%）明顯高于Non-Target-NPs+laser（72.7%）（圖4D-4E），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NPs加上激光照射才具有殺瘤效果，靶向性的NPs具有更好的殺瘤能力。為了進(jìn)一步探討不同治療方法的抗腫瘤效果，采用組織學(xué)和免疫組織化學(xué)方法（包括H&E染色、Ki67檢測和TUNEL檢測），對腫瘤活檢組織進(jìn)行分析。結(jié)果表明Target-NPs+laser處理的腫瘤組織比起其他組，顯示出嚴(yán)重的損傷和大量空泡化，表現(xiàn)出最低的增殖和最高的凋亡水平（圖4F）。
 

圖5. A)原位PANC-1腫瘤模型體內(nèi)光療的時(shí)間表B)在治療過程中不同時(shí)間點(diǎn)記錄的不同組小鼠的生物發(fā)光圖像 C)在第16天記錄各組的平均瘤重，**P<0.01 D)治療后第16天切除脾的腫瘤圖像，比例尺：1cm E)不同治療方法腫瘤組織的H&E、Ki67和TUNEL染色分析，比例尺：200μm

 

最后研究lip-DCTBT NPs用于胰腺原位腫瘤模型的光療效果。將荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組（PBS；PBS+laser；Target-NPs；Non-Target-NPs+laser；Target-NPs+laser）。如圖5B所示，對照組(PBS；PBS+laser；Target-NPs；)腫瘤的熒光信號逐漸增強(qiáng)，相反，實(shí)驗(yàn)組（Non-Target-NPs+laser；Target-NPs+laser）的小鼠在腫瘤部位出現(xiàn)了較弱的熒光強(qiáng)度。五組依次的平均腫瘤解剖重量為0.54、0.57、0.53、0.16和0.04g（5C-5D），這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明lip-DCTBT NPs+laser才具有良好的腫瘤生長抑制作用，靶向性的NPs具有更好的殺瘤能力。之后用H&E染色、Ki67和TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞的增殖活性(圖5E)，驗(yàn)證了上述的結(jié)論。

 

結(jié)論：作者成功開發(fā)了一種AIE活性的光熱敏劑，它同時(shí)具有NIR-II FLI、type-I PDT和PTT功能。通過在CTBT主鏈上合理地引入二苯胺片段，得到具有更好AIE性質(zhì)和吸收、發(fā)射波長紅移的DCTBT分子。為了最大限度地提高光療效果，進(jìn)一步將EGFR靶向多肽修飾的兩親性聚合物DSPE-PEG2000-GE11作為包裹基質(zhì)，來促進(jìn)lip-DCTBT NPs在腫瘤部位的積累。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，Target-NPs在NIR-II FLI引導(dǎo)的I型PDT-PTT協(xié)同治療下，對PANC-1皮下和原位腫瘤模型的腫瘤生長有明顯的抑制作用。這些研究發(fā)現(xiàn)為探索先進(jìn)的胰腺癌光療材料開辟新的視角，并刺激臨床試驗(yàn)的最新發(fā)展。

 

參考文獻(xiàn)

D. Li et al."Synchronously boosting type-I photodynamic and photothermal efficacies via molecular manipulation for pancreatic cancer theranostics in the NIR-II window."Biomaterials.283 (2022) 121476.

 

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