人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與處理及應(yīng)用

　　一、背景

　　人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞是提取于人肺組織的原代細(xì)胞系，血管內(nèi)皮細(xì)胞主要作用是維持血管的動(dòng)態(tài)平衡。此細(xì)胞能合成和分泌凝血和纖溶系統(tǒng)中的活化和抑制因子，同時(shí)也能合成和分泌影響著血小板粘附和聚集的某些介質(zhì)。內(nèi)皮細(xì)胞還可以釋放具有調(diào)控細(xì)胞增殖和血管壁張力功能的分子。人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞上的腺苷受體被脂多糖激活后，會(huì)引起參與急性肺損傷的病生理過(guò)程的IL-6的釋放。許多此類(lèi)以及其他的作用過(guò)程可以應(yīng)用培養(yǎng)的細(xì)胞在體外研究進(jìn)行研究，人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞正是這類(lèi)研究中普遍應(yīng)用的細(xì)胞類(lèi)型。

　　二、細(xì)胞培養(yǎng)步驟

　　培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

　　1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

　　2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

　　3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　三、細(xì)胞處理方法

　　1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

　　2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

　　1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

　　2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

　　3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

　　4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

　　3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

　　四、應(yīng)用

　　用于香煙煙霧提取物經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激CHOP信號(hào)通路促進(jìn)人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡研究：

　　明確香煙煙霧提取物是否經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激CHOP信號(hào)通路促進(jìn)人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,以及苯基丁酸（PBA）是否具有凋亡抑制作用。

　　方法：通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染重組RNA沉默HPAEC人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞CHOP基因表達(dá),將未進(jìn)行CHOP基因干預(yù)的HPAEC人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及CHOP基因沉默的HPAEC-CHOP人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞各自分為對(duì)照組（Ctrl組,常規(guī)培養(yǎng)不作特殊處理）、香煙煙霧提取物組（CSE組,培養(yǎng)基中加入10%香煙煙霧提取物）、苯基丁酸組（PBA組,培養(yǎng)基中加入5mmol/L的PBA）和香煙煙霧提取物聯(lián)合苯基丁酸組（CSE+PBA組,培養(yǎng)基中加入10%香煙煙霧提取物以及5mmol/L的PBA）,各組細(xì)胞分別處理6h、12h、24h,收集后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)變化,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例,Western-blot檢測(cè)CHOP蛋白表達(dá)水平,Realtime-PCR檢測(cè)CHOPmRNA表達(dá)水平。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　結(jié)果：

　　1、HPAEC-CHOP細(xì)胞CHOP蛋白表達(dá)水平較HPAEC細(xì)胞降低大于80%,說(shuō)明CHOP基因沉默達(dá)到預(yù)期效果。

　　2、透射電鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)。Ctrl組以及PBA組HPAEC細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常,CSE組HPAEC細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹（表現(xiàn)為體積增大和折疊變平變淺）,CSE+PBA組HPAEC細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹程度較CSE組HPAEC細(xì)胞減輕。Ctrl組、PBA組以及CSE+PBA組HPAEC-CHOP細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)基本正常;CSE組HPAEC-CHOP細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)明顯腫脹,但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜電子密度增高。

　　3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。HPAEC細(xì)胞不同處理組相同處理時(shí)間比較:PBA組凋亡比例與Ctrl組無(wú)差異;CSE組凋亡比例高于Ctrl組和PBA組;CSE+PBA組凋亡比例高于Ctrl組和PBA組,但是低于CSE組。HPAEC細(xì)胞不同CSE處理時(shí)間組比較,處理12h組高于處理6h組,處理24h組高于處理12h組。HPAEC-CHOP細(xì)胞不同處理組相同處理時(shí)間比較:PBA組凋亡比例與Ctrl組無(wú)差異;CSE組凋亡比例高于Ctrl組和PBA組;CSE+PBA組凋亡比例高于Ctrl組和PBA組,但是低于CSE組。HPAEC-CHOP細(xì)胞不同CSE處理時(shí)間組比較,凋亡比例無(wú)顯著性差異。相同處理時(shí)間HPAEC-CHOP細(xì)胞與HPAEC細(xì)胞比較:HPAEC-CHOP細(xì)胞CSE組凋亡比例低于HPAEC細(xì)胞的CSE組;HPAEC-CHOP細(xì)胞CSE+PBA組凋亡比例低于HPAEC細(xì)胞的CSE組;HPAEC-CHOP細(xì)胞CSE+PBA組凋亡比例低于HPAEC細(xì)胞的CSE+PBA組。