人臍靜脈內(nèi)皮細胞的復(fù)蘇與凍存及其應(yīng)用

　　一、背景

　　人臍靜脈內(nèi)皮細胞是從臍帶靜脈中分離出來的原代細胞。這種細胞是研究內(nèi)皮細胞的模型系統(tǒng)，研究相關(guān)的低氧、炎癥、氧化應(yīng)激、感染反應(yīng)以及正常和腫瘤相關(guān)血管生成等應(yīng)用。TNF-α和IFN-γ等細胞因子會誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞激活（一種炎性反應(yīng)），并導(dǎo)致VCAM-1/CD106等細胞黏附分子上調(diào)，這些上調(diào)可使用熒光標記抗體和細胞成像進行定量。

　　人臍靜脈內(nèi)皮細胞是采用新鮮的健康產(chǎn)婦新生兒臍帶，采用膠原酶Ⅰ型用消化分離得到臍靜脈內(nèi)皮原代細胞。膠原酶是最理想的血管內(nèi)皮細胞分離酶，對細胞間質(zhì)有較強的消化作用，能使上皮細胞與膠原組織成功分離，且不損傷內(nèi)皮細胞，分離出的血管內(nèi)皮細胞數(shù)量多，雜細胞污染少，且細胞貼壁能力強。

　　二、細胞復(fù)蘇

　　從液氮中取出細胞凍存管，迅速放入37℃水浴中解凍至管內(nèi)殘留一點冰屑。用75%酒精擦拭凍存管后，將內(nèi)容物吸至一15ml無菌離心管中，逐滴加入預(yù)溫至37℃的RPMI-1640培液4－5ml混勻，室溫1500rpm離心10分鐘棄上清。再用RPMI-1640培液4－5ml洗滌一次，離心后棄上清，加HUVEC完全培養(yǎng)液4－5ml備用，每支HUVEC凍存管含細胞量為5×105個。

　　三、細胞凍存

　　調(diào)整細胞數(shù)2-5×10個/ml，按含細胞的RPMI-1640液ml數(shù)，配制等量的凍存液。凍存液中FBS占80%，DMSO占20%。例：含細胞的RPMI-1640液為8ml，應(yīng)配凍存液8ml，其中FBS為6.4ml,DMSO為1.6ml，混勻。置細胞懸液于冰浴中，逐滴加入凍存液，邊加邊搖動。加完后用吸管吹打混勻。于冰浴中分裝細胞于凍存管中，1.8ml/管，再將凍存管置于凍存盒內(nèi)置-80℃冰箱，24小時后轉(zhuǎn)入液氮中保存。

　　四、應(yīng)用

　　用于RAS-線粒體依賴的自噬對高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的保護作用及其機制研究：

　　腎素-血管緊張素（RAS）是最常見及最重要的心臟疾病致病因子。但在血管病變中RAS的活化狀態(tài)尚存爭議,而對不伴心肌病變的糖尿病患者是否需要應(yīng)用RAS抑制劑目前更是缺乏直接的理論依據(jù)。臨床試驗則證實血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑具有不同程度的血管內(nèi)皮保護作用,提示RAS可能參與內(nèi)皮功能損傷的進程。但RAS在體內(nèi)的確切致病機制目前尚不清楚,近期的研究發(fā)現(xiàn),在心肌肥厚和心衰小鼠中,線粒體氧化應(yīng)激是RAS的一個值得信賴的靶點。

　　以人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）、糖尿病大鼠及無心血管、腫瘤并發(fā)癥的糖尿病患者為實驗對象,從組織、細胞及分子水平研究RAS-線粒體對高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡、衰老及自噬的影響及作用機制,并對可能的調(diào)控因子進行探討。

　　研究主要探討不同葡萄糖濃度或者高葡萄糖濃度下不同作用時間對人臍靜脈內(nèi)皮細胞衰老、自噬及凋亡的影響。

　　方法：

　　1、HUVEC在無血清ECM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時后,加入不同濃度葡萄糖（11,16.5,22,27.5,33mM）共同作用72h,或者33mmM葡萄糖分別作用72,48,24,6h。ECM培養(yǎng)基基礎(chǔ)葡萄糖濃度5.5mM。同時給予33mM甘露醇作為對照排除滲透壓升高的影響。

　　2、葡萄糖處理后,分別行細胞周期、β-半乳糖苷酶染色、細胞衰老相關(guān)異染色質(zhì)聚集（SAHF）和衰老相關(guān)蛋白檢測評估細胞衰老。

　　3、葡萄糖處理后,檢測自噬標志蛋白及自噬啟動蛋白的表達,并分別給予AICAR、CC調(diào)控自噬啟動蛋白AMPK,評估葡萄糖對內(nèi)皮細胞自噬的影響。

　　4、葡萄糖處理后,流式細胞術(shù)評估葡萄糖對內(nèi)皮細胞凋亡的影響。

　　結(jié)果：

　　1、葡萄糖呈現(xiàn)濃度及劑量依賴性地促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞衰老,且這種促進與滲透壓改變無關(guān)。

　　2、葡萄糖誘導(dǎo)自噬標志蛋白及自噬啟動蛋白的高表達,且獨立于滲透壓改變。抑制AMPK磷酸化反應(yīng)可以廢除高糖誘導(dǎo)的自噬反應(yīng)。

　　3、培養(yǎng)條件下,高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡無明顯影響。

　　結(jié)論：本研究表明,高糖可以明顯促進內(nèi)皮細胞衰老、自噬,但對內(nèi)皮細胞凋亡無明顯影響。且內(nèi)皮細胞損傷為滲透壓非依賴性。