人內(nèi)臟脂肪細(xì)胞的應(yīng)用及復(fù)蘇操作要點(diǎn)

 　　一、背景

　　人內(nèi)臟脂肪細(xì)胞是從臟器脂肪中分離而來。內(nèi)臟脂肪是人體脂肪中的一種，與皮下脂肪不同，它圍繞著人的臟器，主要存在于腹腔內(nèi)，對人的內(nèi)臟起著支撐、穩(wěn)定和保護(hù)的作用。與皮下脂肪庫累積導(dǎo)致的外周型肥胖相比，內(nèi)臟脂肪過度沉積與糖尿病、冠心病等一些肥胖相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此，研究內(nèi)臟脂肪細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制對于肥胖及其相關(guān)疾病的防治具有重要意義。

　　二、復(fù)蘇操作要點(diǎn)

　　1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

　　2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細(xì)胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細(xì)胞)避免引起污染。

　　3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

　　4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。

　　5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

　　6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

　　三、應(yīng)用

　　用于Sirt1對內(nèi)臟脂肪細(xì)胞定向分化的影響及機(jī)制研究：

　　組蛋白去乙�；�酶Sirtuin-1（Sirtl）基因不僅可抑制皮下白色脂肪分化而抑制肥胖,Sirt1過表達(dá)還可促進(jìn)PPAR-γ去乙�；�,招募PRDM16引起皮下白色脂肪的“米色化”而引起顯著的產(chǎn)熱效應(yīng)。但有趣的是,Sirt1轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)臟脂肪中并沒有出現(xiàn)明顯的米色脂肪,提示Sirt1對皮下與內(nèi)臟脂肪的分化調(diào)控存在差別�；�于臨床研究提示Sirt1的表達(dá)水平與內(nèi)臟脂肪沉積密切相關(guān),本研究擬從細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)多層面并結(jié)合Sirt1過表達(dá)及激動劑的應(yīng)用,探討Sirt1對內(nèi)臟脂肪前體分化的調(diào)控作用以及新型Sirt1激動劑BTM-0512對高脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性肥胖的抑制效果及機(jī)制。

　　方法臨床研究：按照一定的納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)收集腹部手術(shù)患者內(nèi)臟脂肪組織,以BMI≥25.0個體為超重/肥胖組,以BMI在18.5-24.9之間個體為對照組；免疫組織化學(xué)檢測脂肪組織中Sirt1、PRDM16蛋白表達(dá)；Real-timePCR檢測Sirt1、全長PRDM16、總PRDM16表達(dá)水平。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選取臨床研究中對照組患者內(nèi)臟脂肪組織進(jìn)行SVF原代細(xì)胞培養(yǎng),通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子標(biāo)記。構(gòu)建Human-Sirtl過表達(dá)慢病毒載體。

　　實(shí)驗(yàn)分組為：①對照組,轉(zhuǎn)染慢病毒包裝的空質(zhì)粒；Sirt1過表達(dá)組,轉(zhuǎn)染慢病毒包裝的Sirt1過表達(dá)質(zhì)粒。提取細(xì)胞總RNA,Real-timePCR檢測Sirt1、全長PRDM16、總PRDM16、UCP1、C/EBPβ、Resistin的mRNA表達(dá)水平；油紅O染色檢測細(xì)胞脂質(zhì)沉積。動物實(shí)驗(yàn)：高脂飲食連續(xù)飼養(yǎng)C57BL/6J小鼠8周建立肥胖模型。造模后分別給予兩種Sirtl激動劑白藜蘆醇及其甲基化衍生物BTM-0512進(jìn)行治療性給藥,實(shí)驗(yàn)分為對照組,模型組,BTM-0512低劑量組（5mg/kg）,BTM-0512中劑量組（10mg/kg）,BTM-0512高劑量組（20mg/kg）,白藜蘆醇組（10mg/kg）。連續(xù)給藥時間分別為2、4、6周,分別檢測體重、體長、內(nèi)臟脂肪濕重。然后選擇給藥4周小鼠,測血糖、血脂,并分別取內(nèi)臟及肩胛間脂肪,提取總RNA,Real-timePCR檢測Sirt1、全長PRDM16、總PRDM16、UCP1、C/EBPβ、Resistin、TMEM26的mRNA表達(dá)水平。

　　結(jié)果：（1）在臨床研究中,與對照組相比,肥胖人群內(nèi)臟脂肪組織中Sirt1與總PRDM16蛋白及mRNA表達(dá)下降,而全長PRDM16mRNA表達(dá)無明顯差異。

　�。�2）在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,與對照組相比,Sirt1基因過表達(dá)組脂質(zhì)沉積明顯降低,同時,Resistin、UCP1、C/EBPβ、全長PRDM16mRNA表達(dá)水平明顯降低,總PRDM16表達(dá)兩組間無明顯差異。

　�。�3）在動物實(shí)驗(yàn)中,與對照組相比,模型組血糖、血脂、體重、Lee’s指數(shù)、內(nèi)臟脂肪指數(shù)明顯升高；BTM-0512及白藜蘆醇明顯降低小鼠血糖、血脂、體重、Lee’s指數(shù)、內(nèi)臟脂肪指數(shù),且BTM-0512較白藜蘆醇作用更加明顯。

　　（4）在動物實(shí)驗(yàn)中,與模型組相比,BTM-0512組和白藜蘆醇組小鼠內(nèi)臟脂肪中Sirt1、總PRDM16mRNA表達(dá)上調(diào),而全長PRDM16、UCP1、C/EBPβ、TMEM26、Resistin表達(dá)則顯著下調(diào)。

　�。�5）在動物實(shí)驗(yàn)中,與模型組相比,BTM0512和白藜蘆醇組小鼠棕色脂肪中Sirt1、UCP1、全長PRDM16與總PRDM16的表達(dá)皆升高,Resistin、C/EBPβ、TMEM26表達(dá)無明顯差異。

　　四、注意事項(xiàng)

　　1、收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

　　2、收到細(xì)胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時（視細(xì)胞密度而定）穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收細(xì)胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細(xì)胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細(xì)胞在運(yùn)輸過程中是否有污染情況。作為我方進(jìn)行銷售依據(jù)。

　　3、由于細(xì)胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運(yùn)輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊�，故本公司只保證客戶收到細(xì)胞后一周內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)，故客戶需要售后時需出示收到細(xì)胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天。

　　4、所有動物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。