維生素D家族的臨床意義和檢測(cè)方法研究

SCIEX的“臨床質(zhì)譜先鋒應(yīng)用專欄”，將持續(xù)為大家?guī)�來�?chuàng)新的具有開拓性的質(zhì)譜臨床應(yīng)用資訊，讓質(zhì)譜更好更多的為臨床服務(wù)。

本期內(nèi)容：

維生素D家族的臨床意義和檢測(cè)方法探討
北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科多年的系統(tǒng)性研究

維生素D的家族成員

日常生活中我們經(jīng)常聽到維生素D，幾乎是維生素中耀眼的明星，簡直就是成功跨界維生素和激素圈的典范！

其實(shí)維生素D的家族非常龐大，還有諸多家族成員可能大家都很少聽過，北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科對(duì)維生素D家族做了全面的研究和探討。今天就讓我們近距離來解讀維生素D家族及他們的作用
（注：排名按照體內(nèi)代謝通路的先后順序）

01. 大哥——維生素D
維生素D包括維生素D₃和維生素D₂兩種形式。皮膚中的7-脫氫膽甾醇受到日光照射后，經(jīng)由維生素D₃前體轉(zhuǎn)化成維生素D₃；另有一小部分維生素D₃可通過食用動(dòng)物性食品而直接攝入。維生素D₂不能由機(jī)體自主合成，但可通過對(duì)一些植物性或菌類食物的攝取來補(bǔ)充。

圖1. 維生素D的化學(xué)結(jié)構(gòu)（圖片來源于維基百科）

02.二哥——25-羥基維生素D
機(jī)體內(nèi)維生素D₂和D₃的代謝方式一致，他們與維生素D結(jié)合蛋白（DBP）結(jié)合，在肝臟中進(jìn)一步代謝，產(chǎn)生25-羥基維生素D（25(OH)D）。

03.雙胎三哥——1,25-雙羥基維生素D，
     24,25-雙羥基維生素D
25(OH)D在近端腎小管中，1位進(jìn)一步羥基化，產(chǎn)生具有激素性質(zhì)的1,25-雙羥基維生素D（1,25(OH)₂D）；25(OH)D在腎24-羥化酶（CYP24A1 )的作用下，產(chǎn)生24,25-雙羥基維生素D（24,25(OH)₂D），雙胞胎的性格竟然迥異，這位幾乎不與維生素D受體（VDR）親和。

04.四弟——1,24,25-三羥基維生素D
在腎24-羥化酶（CYP24A1 )的作用下， 1,25(OH)₂D進(jìn)一步羥基化產(chǎn)生1,24,25-三羥基維生素D（1,24,25(OH)₃D），四弟也比較有個(gè)性，幾乎不與維生素D受體（VDR）親和。

05.影子兄弟——C3異構(gòu)化的維生素D兄弟
上述所有兄弟們（代謝產(chǎn)物）都有C3異構(gòu)化的傾向，異構(gòu)化之后性情大變，與VDR和DBP的親和力降低，和原來的兄弟們（非異構(gòu)化狀態(tài)）相比，活性也降低，真是自由的影子們。

圖2. 維生素D在體內(nèi)的代謝途徑（圖片來源于維基百科）

維生素D家族成員的臨床意義

五兄弟在體內(nèi)互助友愛，但有時(shí)也會(huì)有競爭。

 大哥維生素D

在維持鈣磷濃度穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，他的缺乏會(huì)導(dǎo)致兒童佝僂病及成人軟骨病等。體循環(huán)中的大哥維生素D主要有3種存在形式：約85%-90%的維生素D與維生素D結(jié)合蛋白（DBP）結(jié)合；10%-15%與白蛋白（Alb）結(jié)合；僅有少于0.1%的維生素D以游離形式存在 。其中，與白蛋白結(jié)合型和游離型又被稱為“生物可利用型”，各型態(tài)在體內(nèi)會(huì)迅速變身為其他兄弟形式，非常難以檢測(cè)。

二哥25(OH)D——反映維生素D狀態(tài)的優(yōu)質(zhì)指標(biāo)

25(OH)D是血清總25(OH)D為25(OH)D₂與25(OH)D₃之和，是大哥的主要循環(huán)代謝物，體內(nèi)含量較高（ng/ml），易于檢測(cè)。機(jī)體中總維生素D水平會(huì)受到機(jī)體肝、腎功能，激素水平，不同種族等多因素影響。在建立檢測(cè)參考區(qū)間時(shí)，須綜合考慮上述因素。

而血清中游離25(OH)D水平則不易受到上述因素影響。游離激素假說認(rèn)為：與血清中總25(OH)D相比，以游離或生物可利用的25(OH)D作為維生素D功能標(biāo)志物更有意義。其水平更能準(zhǔn)確反映機(jī)體是否缺乏維生素D 的狀態(tài)。

雙胎三哥之一1,25(OH)₂D——公認(rèn)明確的具生物學(xué)活性代謝產(chǎn)物

1,25(OH)₂D是維生素D的具有生物學(xué)活性代謝產(chǎn)物，其合成代謝受到多重因子的嚴(yán)格調(diào)控，即便在機(jī)體表現(xiàn)出維生素D缺乏的不良反應(yīng)時(shí)，1,25(OH)₂D水平也被嚴(yán)格控制在限制范圍內(nèi)。但仍存在一些疾病會(huì)擾亂維生素D 代謝產(chǎn)生1,25(OH)₂D，使1,25(OH)₂D的濃度超出正常范圍，而通常25(OH)D濃度水平不會(huì)變化。

所以對(duì)1,25(OH)₂D的有效檢測(cè)，可以對(duì)這些疾病進(jìn)行鑒別診斷：
（1）1α羥化酶缺乏癥的判定；
（2）判定低血磷綜合征是否由成纖維細(xì)胞生長因子（FGF23）介導(dǎo)；
（3）揭示維生素D抗性佝僂病，早發(fā)性佝僂病等；
（4）預(yù)防骨骼疾病并發(fā)癥。

雙胎三哥之二24,25(OH)₂D——有些神秘的三哥

到目前為止，有關(guān)24,25(OH)₂D的生理活性作用，以及是否存在特異的受體，始終沒有明確的認(rèn)識(shí)。

有相關(guān)研究表明，25(OH) D/24,25(OH)₂D比值是維生素D分解代謝的明確標(biāo)志物，該比值的升高也可作為維生素D缺乏的潛在指標(biāo)，用以預(yù)測(cè)維生素D的補(bǔ)充效果。

同時(shí)，該比值還可用來鑒別CYP24A1突變繼發(fā)性高鈣血癥患者，如特發(fā)性嬰兒高鈣血癥(IIH)，一種罕見的遺傳性疾病。

此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，高水平的24,25(OH)₂D和較高的25(OH)D/24,25(OH)₂D比值與較低的髖部骨折風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，盡管25(OH)D本身與髖部骨折無關(guān)。

還有一些隱世高手——其他代謝物

除了25(OH)D、1,25(OH)₂D和24,25(OH)₂D之外，還有更多的維生素D家族成員（代謝物）被發(fā)現(xiàn)，但這些代謝物很少被檢測(cè)。以目前的技術(shù)水平，許多濃度低于1,25(OH)₂D濃度水平的代謝物無法被量化，而這些代謝物對(duì)疾病診斷的意義也仍然難以解釋。然而，未來的研究可能會(huì)找到檢測(cè)和使用這些代謝物的方法，為臨床診斷提供新的指標(biāo)工具。

北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)進(jìn)行維生素D家族歷時(shí)9年的檢測(cè)研究

1. 二哥——25(OH)D

二哥——25(OH)D的檢測(cè)方法中有兩種占主導(dǎo)地位：自動(dòng)免疫測(cè)定法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。在健康個(gè)體中，這些檢測(cè)方法有很好的相關(guān)性，然而在患者組中，25(OH)D的不同檢測(cè)方法間存在一定的偏差。

表1. 25(OH)D的主流檢測(cè)方法

北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科在質(zhì)譜系統(tǒng)上建立了一種快速檢測(cè)血清中24,25(OH)₂D₂, 24,25(OH)₂D₃, 25(OH)D₂, 和 25(OH)D₃水平的LC-MS/MS方法，能夠有效區(qū)分非活性的C3差向異構(gòu)體。實(shí)驗(yàn)者對(duì)23,695例樣本（2015-2017年）中25(OH)D₂ 和 25(OH)D₃含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，闡述分別檢測(cè)25(OH)D₂ 和 25(OH)D₃的必要性。（表3中文獻(xiàn)編號(hào)1, 2, 3, 4, 6, 7）

2.游離二哥——游離型25(OH)D

目前，游離型25(OH)D的檢測(cè)可以分為直接檢測(cè)法和間接計(jì)算法兩種。

表2. 游離型25(OH)D的不同檢測(cè)方法

北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科采用超濾法對(duì)血清進(jìn)行前處理，針對(duì)血清中游離25(OH)D₃建立了一種基于LC-MS/MS技術(shù)的直接檢測(cè)方法。并對(duì)300余例老年人體內(nèi)游離25(OH)D₃含量，比較了其與總25(OH)D₃、肝、腎功能的相關(guān)性。（表3中文獻(xiàn)編號(hào)11）

3.雙胎三哥之一——1,25(OH)₂VD

1,25(OH)₂VD體內(nèi)濃度較低（pg/ml），對(duì)檢測(cè)平臺(tái)要求相對(duì)較高。北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科在質(zhì)譜系統(tǒng)上建立了一種快速檢測(cè)血清中1,25(OH)₂D₂和1,25(OH)₂D₃水平的LC-MS/MS方法。該方法前處理簡單，靈敏度高，滿足相關(guān)方法學(xué)驗(yàn)證要求。（表3中文獻(xiàn)編號(hào)5）

4.雙胎三哥之二——24,25(OH)₂VD

目前，尚無免疫學(xué)方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)24,25(OH)₂VD的檢測(cè)。24, 25(OH)₂D₃的濃度約為25(OH)D濃度的10%-15%。國內(nèi)外學(xué)者建立了24,25(OH)₂VD檢測(cè)的質(zhì)譜方法。

北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科在質(zhì)譜系統(tǒng)上建立了一種快速檢測(cè)血清中24,25(OH)₂D₂和24,25(OH)₂D₃水平的LC-MS/MS方法。該方法準(zhǔn)確可靠，且能夠有效區(qū)分C3差向異構(gòu)體。對(duì)中國6個(gè)不同省市的1211例樣本中24,25(OH)₂VD水平及25(OH)VD/24,25(OH)₂VD比值進(jìn)行評(píng)估。比較了不同性別，年齡，區(qū)域?qū)τ谠摻Y(jié)果的影響。（表3中文獻(xiàn)編號(hào)8, 9, 10）。2022年，再次發(fā)表文章建立了一個(gè)穩(wěn)健的可同時(shí)進(jìn)行十種維生素D及其異構(gòu)體檢測(cè)的方法（包括 25(OH)D, 1.25(OH)₂D, 24,25(OH)₂D 及其3位異構(gòu)體等）（表3中文獻(xiàn)編號(hào)12）。

北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科質(zhì)譜平臺(tái)介紹

北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科成立于1958年，是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)系所在地。于2008年通過國家合格評(píng)定認(rèn)可委員會(huì)組織的專家評(píng)審并獲得ISO15189認(rèn)可證書；于2014年通過美國臨床病理家學(xué)會(huì)（CAP）的實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可；近十余年來承擔(dān)了自然科學(xué)基金、科技部，衛(wèi)生部公益行業(yè)基金，世界衛(wèi)生組織等多項(xiàng)科研項(xiàng)目。

北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科關(guān)注學(xué)科發(fā)展方向，著力打造臨床質(zhì)譜平臺(tái)。2012年9月，由國家臨床重點(diǎn)�？平ㄔO(shè)項(xiàng)目支持，引進(jìn)了第一臺(tái)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS），之后在醫(yī)院的大力扶持下，又先后購置了一臺(tái)ICP-MS和兩臺(tái)LC-MS/MS，不斷擴(kuò)展臨床服務(wù)項(xiàng)目，滿足臨床疑難雜癥及精準(zhǔn)診斷的需求，并發(fā)表了數(shù)篇LC-MS/MS技術(shù)相關(guān)文章。

表3. 協(xié)和檢驗(yàn)歷時(shí)9年發(fā)表維生素D家族相關(guān)文章列表
及內(nèi)容釋義（按發(fā)表時(shí)間排序）

[1] Dirks, Niek F., et al. "The when, what & how of measuring vitamin D metabolism in clinical medicine." Nutrients 10.4 (2018): 482.

[2] Deeb, Kristin K., Donald L. Trump, and Candace S. Johnson. "Vitamin D signalling pathways in cancer: potential for anticancer therapeutics." Nature reviews cancer 7.9 (2007): 684-700.

[3] Bikle, Daniel D., Sofie Malmstroem, and Janice Schwartz. "Current controversies: are free vitamin metabolite levels a more accurate assessment of vitamin D status than total levels?." Endocrinology and Metabolism Clinics 46.4 (2017): 901-918.

[4] Tsuprykov, Oleg, et al. "Why should we measure free 25 (OH) vitamin D?." The Journal of steroid biochemistry and molecular biology 180 (2018): 87-104.