FlexStation3多功能酶標儀在鑒定阻斷hERG通道化合物中的應用
簡介
藥物誘導的人類 hERG 離子通道阻滯與患者潛在的致死性室性快速心律失常的易感性有關(guān)。近年來，F(xiàn)DA 批準的一些藥物由于對 hERG 的脫靶作用而退出市場。因此，在藥物發(fā)現(xiàn)過程的早期階段，迫切需要鑒定能夠阻斷 hERG 通道的化合物。在此，我們展示在 FlexStation 3 多功能酶標儀上，一種新的
鉀離子通道檢測試劑盒研究 hERG 化合物活性的用途。這種分析方法利用了鉈離子 (Tl+ ) 的滲透性，通過鉀離子通道進入胞質(zhì)，然后被一種新型熒光指示劑檢測到。7 種參照的 hERG阻滯劑在中等 通 量 細胞試 驗中進 行檢 測，并將 FLIPR TetraSystem 和 IonWorks Barracuda Plus Automated Patch Clamp System 收集的數(shù)據(jù)值進行比較。
優(yōu)點
•細胞水平的鉀離子通道活性的功能測定
•均相免洗特性可降低孔間差異并簡化操作流程
•相比于非均質(zhì)化實驗，擴展了信號窗口
圖 1 FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒的原理。
材料和方法
制備化合物
實驗流程
劑。在起始的染料加樣步驟，鉈離子指示劑以乙氧基甲基酯(AM) 的形式通過被動擴散穿過細胞膜進入細胞內(nèi)。細胞質(zhì)的酯酶可切割 AM 酯并釋放其活性熒光構(gòu)型。此外，一種具有專利的掩蔽染料應用于細胞外以降低背景熒光。細胞被鉀離子和鉈離子的混合物或鉈離子存在下的配體刺激，可以激活鉀離子通道。熒光信號的增加表示鉈離子流入細胞內(nèi)，確切地說是通過鉀通道流入，因此顯示了鉀離子通道功能性的活性 測 量。FLIPR Potassium Assay Explorer Kit (MolecularDevices Cat# R8222) 試劑盒包含鉈離子敏感的染料，掩蔽染料用于均質(zhì)化操作，200 mM 硫酸鉀，50mM 硫酸鉈，5x 無氯緩沖液，HBSS + 20 mM HEPES 緩沖液。此試劑盒支持 10 塊96 孔或 384 孔板。實驗流程如圖 2。
制備化合物
化合物的疏水性質(zhì)影響表觀效力值，可能是由于與實驗器具的非特異性結(jié)合。在這項研究中，化合物首先在 100% DMSO中稀釋，然后在檢測前立即與 HBSS + 20 mM HEPES 緩沖液一同轉(zhuǎn)移至玻璃內(nèi)襯的聚丙烯板中。
實驗流程
人 hERG 離子通道基因Kv11.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞，由ChanTest Corporation (Cleveland, OH) 公司提供。在實驗前兩天，以 25000 個細胞 / 孔的密度將細胞種在黑色透明底的 96 孔板中，加入含有選擇抗生素的生長培養(yǎng)基并在 37℃和 5% CO2 環(huán)境下孵育。在實驗前的 24 小時，將生長培養(yǎng)基換成含有四環(huán)素的誘導培養(yǎng)基。實驗前的 4 小時，將細胞孵育溫度從 37° C 切換到 28℃，以增強細胞膜上 hERG 離子通道的表達。微孔板細胞與染料一起在室溫下避光孵育 1 小時。
藥理學分析時，首先加入 hERG 通道阻滯化合物，室溫孵育30 分鐘。在 FlexStation 3 酶標 儀檢 測時，添加先前優(yōu)化過的刺激緩沖液至每個孔中。在 SoftMax Pro 軟件中設置激發(fā)波長 485nm, 發(fā) 射 波長 538nm。每 列的信號采 集 大 約 120秒， 間 隔 1.52 秒。 為了 進 行 對 比，使 用 FluxOR Assay Kit(Life Technologies) 試劑盒，按其實驗手冊進行平行試驗。數(shù)據(jù)分析在 SoftMax Pro 軟件和 GraphPad Prism 軟件中完成。
通 過確定刺激 hERG 通 道 所需的鉈 和鉀的最佳濃 度 進 行實驗方法的開發(fā)。在微孔板中測試不同濃度組合的硫酸鉀和硫酸鉈的刺激緩沖液，鉈離子和鉀離子緩沖液使 用 1x 無氯 緩沖液稀釋。硫酸鉈和硫酸鉀每摩爾有兩倍量的陽離子，因此我們認為它們的陽離子濃度是各自濃度的 2 倍。檢測時，將刺 激緩沖液加入孔中的細胞比較不同濃度組合的信號軌跡，以確定提供最大信號的最佳濃度組合。使用 FLIPR TetraSystem 得到的數(shù)據(jù)顯示，能夠刺激 hERG 并提供最大信號的最優(yōu)或最終的鉈離子濃度是 1 mM，鉀離子濃度時 10 mM。
圖 2 在 FlexStation 3 酶標儀上，F(xiàn)LIPR 鉀離子通道檢測試劑盒的工作流程。
圖 3 在 IonWorks Barracuda System 上的電生理實驗。將化合物以 3x 的濃度加入 1% DMSO 中，再在孔中與緩沖液混合，稀釋至終濃度為 1x 的化合物于 0.33% DMSO�；衔锓跤� 5 分鐘后，按如下電壓操作，+40 mV 刺激一秒，隨后一秒至 -50 mV，測量峰值尾電流。
圖 4 阻 斷 hERG通道活性的代表性化合物的濃度響應曲線。在FlexStation 3 酶標儀上收集得到數(shù)據(jù)。
圖 5 FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒的結(jié)果與競爭者試劑盒相比較。
圖 6 FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒的信號動態(tài)范圍與競爭者試劑盒相比較。4 uM 特非那定作為陰性對照，刺激緩沖液作為陽性對照。FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒的 Z factor = 0.67，n = 8；競爭試劑盒的 Z factor = 0.43，n = 8。
可與如下的 Molecular Devices 產(chǎn)品兼容。
可與如下的 Molecular Devices 產(chǎn)品兼容。
表 1 FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒，在 FlexStation 3 酶標儀、FLIPRTetra System、IonWorks Barracuda System 三套系統(tǒng)上得到的 IC50值進行對比。
表 2 FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒與競爭試劑盒的 IC50 結(jié)果比較。
電生理
為了進 行比較，從 IonWorks Barracuda 全自動膜 片鉗系統(tǒng)獲得了同一組 hERG 通道阻斷劑的 IC
50 值 ( 圖 3 )。為了捕獲化合物使用依賴性的效應，在化合物添加前后，施加 5 次 0.1Hz 的電壓。hERG 尾電流在第五次掃描時的峰值振幅被用來測量該化合物的效應。
結(jié)果
在 FlexStation 3 酶標儀上使用 FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒鑒定七個已知的 hERG 通道阻滯劑�；衔锏臐舛软憫� 如 圖 4。 在 FLIPR Tetra System、IonWorks BarracudaSystem 兩套系統(tǒng)上得到的 IC50值 進 行對比，如表 1 所示。這三種檢測系統(tǒng)中的 IC50 值在半對數(shù) (1/2log) 范圍內(nèi)有較好的相關(guān)性，化合物效價的排序保持不變。
另外，四 個化合物被用來評估基于鉈離子的參照實驗劑盒( FluxOR 鉀離子通道實驗)的性能( 圖 5 )。除了西沙必 利 (cisapride) 之外，實驗獲得的IC50值都是相似的，如表 2 所示。 西沙必利通過FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒得到的IC50 值 更 接 近 于 FLIPR Tetra System、IonWorksBarracuda System 兩套系 統(tǒng) 得到的 值。FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒提供的平均信號窗口約為 225% ( % 確定為基線 )明顯高于 FluxOR 試劑盒的平均值 90%，每組 8 個樣本。為了進行統(tǒng)計分析，能完全阻斷 hERG 通道響應的 4uM 特非那定 (terfenadine) 作為陰性 對照，陽性 對照選 擇引起 最 大的hERG 通道響應的刺激緩沖液。FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒獲得的更高 Z 因子得益于更低的孔間變異性和更寬的信號窗口 ( 圖 6 )。這可能是因為 FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒是一種真正的均質(zhì)性檢測實驗，不需要清洗步驟或更換介質(zhì)，因此具有更低的孔間變異性。
另外，四 個化合物被用來評估基于鉈離子的參照實驗劑盒( FluxOR 鉀離子通道實驗)的性能( 圖 5 )。除了西沙必 利 (cisapride) 之外，實驗獲得的IC50值都是相似的，如表 2 所示。 西沙必利通過FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒得到的IC50 值 更 接 近 于 FLIPR Tetra System、IonWorksBarracuda System 兩套系 統(tǒng) 得到的 值。FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒提供的平均信號窗口約為 225% ( % 確定為基線 )明顯高于 FluxOR 試劑盒的平均值 90%，每組 8 個樣本。為了進行統(tǒng)計分析，能完全阻斷 hERG 通道響應的 4uM 特非那定 (terfenadine) 作為陰性 對照，陽性 對照選 擇引起 最 大的hERG 通道響應的刺激緩沖液。FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒獲得的更高 Z 因子得益于更低的孔間變異性和更寬的信號窗口 ( 圖 6 )。這可能是因為 FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒是一種真正的均質(zhì)性檢測實驗，不需要清洗步驟或更換介質(zhì)，因此具有更低的孔間變異性。
結(jié)論
FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒使用均質(zhì)化、無需清洗的操作方案來測量鉀離子通道的功能活性。此研究中，我們使用一系列的參照的 hERG 阻滯劑來證明 FlexStation 3 酶標儀的獲得的結(jié)果與使用 FLIPR Tetra System 和電生理方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)具有強烈的相關(guān)性。
另一組實驗中，F(xiàn)LIPR 鉀離子通道檢測試劑盒相比于競爭試劑盒產(chǎn)品，顯示了明顯更大的試驗窗口和更高的 Z 因子。改進的試驗質(zhì)量聯(lián)合 FlexStation 3 多功能酶標儀的中等通量能力或者 FLIPR Tetra System 的高通量能力，能夠在藥物發(fā)現(xiàn)的早期過程為 hERG 的特征分析提供一個有力的平臺。
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參考文獻
1. Characterization of hERG channel blockers using the FLIPR Potassium Assay Kit, Application Note, 2015.
2. D. Rampe, et al, A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG, FEBS Letters 1997; 417(1): 28-32.
3. Karen Cook, James L. Costantin, and Xin Jiang, Validation of the IonWorks Barracuda System for hERG Ion Channel Assay, Application Note, 2011
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