細胞因子釋放（CRA）在新冠肺炎中T細胞免疫疫苗開發(fā)和治療的應用
新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)導致的新冠肺炎（COVID-19）自2019年至今仍然在全球蔓延，其變異株Omicron由于高傳播率目前已取代其它毒株成為全球新冠的主要流行毒株。各國已采取大規(guī)模疫苗接種，通過其產(chǎn)生的中和抗體和抗病毒T細胞來緩解和對抗新冠肺炎。有研究報道，病毒特異性T細胞在病毒清除（即SARS-CoV-1感染后17年）和在抗體滴度減弱的COVID-19患者中檢測到SARS-CoV-2特異性T細胞會持續(xù)很長時間。因此需要充分了解新冠肺炎中T細胞免疫過程，對疫苗開發(fā)和免疫治療具有重要意義。
COVID-19患者中的T細胞免疫反應
T細胞免疫反應是高度特異性的，在引發(fā)有效的抗病毒反應方面具有不可或缺的作用。在SARS-CoV-2感染的早期階段，樹突狀細胞(DC)和巨噬細胞可以吞噬病毒感染的細胞，通過抗原呈遞啟動T細胞反應。隨后，CD4+T細胞刺激B細胞產(chǎn)生病毒特異性抗體，細胞毒性CD8+T細胞靶向病毒感染的細胞。有研究報道，SARS-CoV-2特異性CD4+和CD8+T細胞在COVID-19癥狀發(fā)作后的前2周內(nèi)的外周血中很明顯。大多數(shù)SARS-CoV-2特異性CD4+T細胞表現(xiàn)出中樞記憶表型，主要產(chǎn)生Th1細胞因子，而CD8+T細胞具有更高水平的穿孔素表達的效應表型。
另外有研究報道COVID-19患者T細胞活化的異質(zhì)性，并提供證據(jù)表明CD4+和CD8+T細胞都能夠產(chǎn)生有效的免疫反應，并出現(xiàn)受損或過度的T細胞反應。輕度COVID-19患者的T細胞升高，產(chǎn)生強大的抗病毒免疫反應。特別是CD8+T細胞表達更高水平的細胞毒性分子，例如顆粒酶A和FAS配體，它們有利于消除病毒感染的細胞。然而，在嚴重疾病病例中，CTL（Cytotoxic T cells，細胞毒性T細胞）比例減少，且幼稚和中樞記憶CD8+T細胞的百分比均較低。此外，與健康對照組相比，COVID-19患者的終末分化效應CD4+和CD8+T細胞的百分比更高。且重癥COVID-19患者的調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)水平低于輕癥患者�？傊琓細胞亞群（包括Treg、Th1、幼稚和記憶T細胞）平衡中的這些失調(diào)可能導致嚴重的炎癥狀況，并可能導致COVID-19復發(fā)。
盡管由CD4+和CD8+T細胞介導的早期抗病毒反應最有可能具有保護作用，但SARS-CoV-2有效的先天免疫逃避能力使T細胞難以通過限制I型和III型干擾素反應來產(chǎn)生有效的抗病毒反應。
COVID-19恢復期患者和健康人中的T細胞免疫反應
恢復康復患者的T細胞計數(shù)可以為T細胞在抗病毒反應中的作用提供重要參考。有研究報道，超過70%的COVID-19恢復期患者存在SARS-CoV-2特異性T細胞。100% CD4+T細胞和70% CD8+T細胞在康復患者中具有SARS-CoV-2 Spike特異性反應。功能測定證實CD4+T細胞表現(xiàn)為Th1表型并產(chǎn)生大量IFN-γ，和針對S蛋白較低水平的IL-4、IL-13、IL-5或IL-17A。同樣，大多數(shù)SARS-CoV-2刺突特異性CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ，絕大多數(shù)IFN-γ+CD8+T細胞也共表達顆粒酶B和腫瘤壞死因子α (TNFα)。這些數(shù)據(jù)表明，康復患者中的大多數(shù)CD4+和CD8+T細胞產(chǎn)生了針對S蛋白的大量抗病毒免疫反應，說明功能性T細胞在病毒清除和恢復中的重要性。此外，這些數(shù)據(jù)也說明利用SARS-CoV-2的S蛋白作為疫苗生產(chǎn)關鍵候選者的重要性。
T細胞反應在無癥狀和未接觸過的個體中觀察到的T細胞反應最低。但是即使沒有并發(fā)的體液反應，無癥狀/輕度恢復期的COVID-19患者也可以產(chǎn)生強大而持久的記憶T細胞反應來預防復發(fā)性感染。有研究報道，與有癥狀的個體相比，無癥狀患者的免疫反應較弱，并且相當一部分有癥狀的患者在恢復期早期表現(xiàn)出中和抗體量減少。COVID-19恢復期患者在出院后2周內(nèi)也顯示出與針對人ACE2的中和抗體滴度和病毒特異性T細胞計數(shù)的強相關性。
細胞因子風暴
細胞因子風暴是指在各種病理條件下檢測到的大量促炎細胞因子和趨化因子，是在SARS-CoV-2感染患者中觀察到的關鍵病理特征之一。在重癥COVID-19患者中記錄到高細胞因子水平。各種免疫細胞類型，包括巨噬細胞、中性粒細胞、DC，以及NK、B和T細胞，可導致COVID-19患者的細胞因子風暴和炎癥反應的過度激活狀態(tài)。
基于T細胞免疫的疫苗研究
SARS-CoV-2完整基因組的快速可用性可用于開發(fā)多種疫苗，使其在刺激幼稚T細胞后產(chǎn)生效應和記憶T細胞，發(fā)揮免疫保護。成功的SARS-CoV-2疫苗應該產(chǎn)生對有效免疫反應具有高度特異性的SARS-CoV-2反應性T細胞，而不會產(chǎn)生炎癥或疾病開始的不良影響。
SARS-CoV-2的蛋白被確定為最適合疫苗開發(fā)的靶標，以觸發(fā)病毒特異性T細胞反應和體液免疫反應。表達S蛋白的腺病毒病毒載體疫苗，即5型腺病毒(Ad5-nCoV)，在健康個體(NCT04313127)中檢測其疫苗的安全性和耐受性，觀察到施用2周后成功產(chǎn)生特異性抗病毒T細胞和體液免疫反應。Moderna開發(fā)了基于mRNA的疫苗，編碼SARS-CoV-2抗原（S蛋白），通過脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)給藥。因mRNA疫苗可以模擬天然病毒感染，并僅編碼抗原蛋白并且不能整合到宿主染色體中。因此，基于mRNA的疫苗更能發(fā)揮細胞免疫和體液免疫。
T細胞免疫檢測---細胞因子釋放（CRA）檢測
總結(jié)
因T細胞免疫反應在疾病的早期階段表現(xiàn)出保護作用，也可能導致致命合并癥的發(fā)生，因此COVID-19的治療和預防中需要深入地了解疾病過程中的免疫反應。特別是在癥狀輕微的患者中阻斷促炎細胞因子的早期治療干預可能會產(chǎn)生有害影響，并導致免疫反應不足和病毒清除受損。在危重COVID-19患者中恢復T細胞耗竭和改善過度炎癥反應的晚期治療干預可能具有更好的臨床結(jié)果。在疫苗開發(fā)中，也要充分考慮其是否可以增強抗病毒免疫和特定T細胞反應從而加強疫苗保護的持久性。
參考文獻：
Robust T Cell Immunity in Convalescent Individuals with Asymptomatic or Mild COVID‐19.
Highly functional virus‐specific cellular immune response in asymptomatic SARS-CoV‐2 infection.
T‐cell responses and therapies against SARS‐CoV‐2 infection.
Rapid determination of the wide dynamic range of SARS‐CoV‐2 Spike T cell responses in whole blood of vaccinated and naturally infected.
COVID-19患者中的T細胞免疫反應
T細胞免疫反應是高度特異性的，在引發(fā)有效的抗病毒反應方面具有不可或缺的作用。在SARS-CoV-2感染的早期階段，樹突狀細胞(DC)和巨噬細胞可以吞噬病毒感染的細胞，通過抗原呈遞啟動T細胞反應。隨后，CD4+T細胞刺激B細胞產(chǎn)生病毒特異性抗體，細胞毒性CD8+T細胞靶向病毒感染的細胞。有研究報道，SARS-CoV-2特異性CD4+和CD8+T細胞在COVID-19癥狀發(fā)作后的前2周內(nèi)的外周血中很明顯。大多數(shù)SARS-CoV-2特異性CD4+T細胞表現(xiàn)出中樞記憶表型，主要產(chǎn)生Th1細胞因子，而CD8+T細胞具有更高水平的穿孔素表達的效應表型。
另外有研究報道COVID-19患者T細胞活化的異質(zhì)性，并提供證據(jù)表明CD4+和CD8+T細胞都能夠產(chǎn)生有效的免疫反應，并出現(xiàn)受損或過度的T細胞反應。輕度COVID-19患者的T細胞升高，產(chǎn)生強大的抗病毒免疫反應。特別是CD8+T細胞表達更高水平的細胞毒性分子，例如顆粒酶A和FAS配體，它們有利于消除病毒感染的細胞。然而，在嚴重疾病病例中，CTL（Cytotoxic T cells，細胞毒性T細胞）比例減少，且幼稚和中樞記憶CD8+T細胞的百分比均較低。此外，與健康對照組相比，COVID-19患者的終末分化效應CD4+和CD8+T細胞的百分比更高。且重癥COVID-19患者的調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)水平低于輕癥患者�？傊琓細胞亞群（包括Treg、Th1、幼稚和記憶T細胞）平衡中的這些失調(diào)可能導致嚴重的炎癥狀況，并可能導致COVID-19復發(fā)。
盡管由CD4+和CD8+T細胞介導的早期抗病毒反應最有可能具有保護作用，但SARS-CoV-2有效的先天免疫逃避能力使T細胞難以通過限制I型和III型干擾素反應來產(chǎn)生有效的抗病毒反應。
COVID-19恢復期患者和健康人中的T細胞免疫反應
恢復康復患者的T細胞計數(shù)可以為T細胞在抗病毒反應中的作用提供重要參考。有研究報道，超過70%的COVID-19恢復期患者存在SARS-CoV-2特異性T細胞。100% CD4+T細胞和70% CD8+T細胞在康復患者中具有SARS-CoV-2 Spike特異性反應。功能測定證實CD4+T細胞表現(xiàn)為Th1表型并產(chǎn)生大量IFN-γ，和針對S蛋白較低水平的IL-4、IL-13、IL-5或IL-17A。同樣，大多數(shù)SARS-CoV-2刺突特異性CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ，絕大多數(shù)IFN-γ+CD8+T細胞也共表達顆粒酶B和腫瘤壞死因子α (TNFα)。這些數(shù)據(jù)表明，康復患者中的大多數(shù)CD4+和CD8+T細胞產(chǎn)生了針對S蛋白的大量抗病毒免疫反應，說明功能性T細胞在病毒清除和恢復中的重要性。此外，這些數(shù)據(jù)也說明利用SARS-CoV-2的S蛋白作為疫苗生產(chǎn)關鍵候選者的重要性。
T細胞反應在無癥狀和未接觸過的個體中觀察到的T細胞反應最低。但是即使沒有并發(fā)的體液反應，無癥狀/輕度恢復期的COVID-19患者也可以產(chǎn)生強大而持久的記憶T細胞反應來預防復發(fā)性感染。有研究報道，與有癥狀的個體相比，無癥狀患者的免疫反應較弱，并且相當一部分有癥狀的患者在恢復期早期表現(xiàn)出中和抗體量減少。COVID-19恢復期患者在出院后2周內(nèi)也顯示出與針對人ACE2的中和抗體滴度和病毒特異性T細胞計數(shù)的強相關性。
細胞因子風暴
細胞因子風暴是指在各種病理條件下檢測到的大量促炎細胞因子和趨化因子，是在SARS-CoV-2感染患者中觀察到的關鍵病理特征之一。在重癥COVID-19患者中記錄到高細胞因子水平。各種免疫細胞類型，包括巨噬細胞、中性粒細胞、DC，以及NK、B和T細胞，可導致COVID-19患者的細胞因子風暴和炎癥反應的過度激活狀態(tài)。
由先天免疫細胞釋放的TNFα、IL-6和IL-1β可能是SARS-CoV-2感染晚期患者發(fā)生細胞因子釋放綜合征和嚴重全身炎癥反應的主要驅(qū)動力之一，其中一些可能是導致這些患者淋巴細胞減少或Th1反應不足的潛在機制之一。另據(jù)報道，在COVID-19重癥病例中，血清TNFα和IL-6水平升高與總T細胞計數(shù)呈負相關，表明這些細胞因子可能參與淋巴細胞減少和T細胞丟失。相反，處于恢復期的患者上述細胞因子的血清水平顯著降低，并顯示T細胞計數(shù)恢復。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，有人提出IL-6阻滯劑，如sarilumab、siltuximab和tocilizumab，以及IL-1β受體阻滯劑用于治療重癥COVID-19患者以解決過度炎癥和控制炎癥的傳播。趨化因子和細胞因子水平升高，例如CCL2/3/5、CXCL8/9/10和IFN-γ、TNFα、IL-1β、IL-1RA、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12 、IL-33、粒細胞/粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（G-CSF和GM-CSF）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）和血小板衍生生長因子亞基B（PDGFB），促進其它白細胞向組織的募集，導致組織損傷。
SARS-CoV-2完整基因組的快速可用性可用于開發(fā)多種疫苗，使其在刺激幼稚T細胞后產(chǎn)生效應和記憶T細胞，發(fā)揮免疫保護。成功的SARS-CoV-2疫苗應該產(chǎn)生對有效免疫反應具有高度特異性的SARS-CoV-2反應性T細胞，而不會產(chǎn)生炎癥或疾病開始的不良影響。
SARS-CoV-2的蛋白被確定為最適合疫苗開發(fā)的靶標，以觸發(fā)病毒特異性T細胞反應和體液免疫反應。表達S蛋白的腺病毒病毒載體疫苗，即5型腺病毒(Ad5-nCoV)，在健康個體(NCT04313127)中檢測其疫苗的安全性和耐受性，觀察到施用2周后成功產(chǎn)生特異性抗病毒T細胞和體液免疫反應。Moderna開發(fā)了基于mRNA的疫苗，編碼SARS-CoV-2抗原（S蛋白），通過脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)給藥。因mRNA疫苗可以模擬天然病毒感染，并僅編碼抗原蛋白并且不能整合到宿主染色體中。因此，基于mRNA的疫苗更能發(fā)揮細胞免疫和體液免疫。
T細胞免疫檢測---細胞因子釋放（CRA）檢測
疫苗中的抗體測試是常規(guī)進行的，但因為特異性病原體的T細胞在血液中存在的總T細胞（通常小于1-3%）中只占很小的一部分，需要在從全血中純化的細胞中進行。而這些檢測都需要復雜的設備和高度專業(yè)化的人員，這可能不是每個常規(guī)實驗室都可以使用的。
杜克-新加坡國立大學Antonio Bertoletti教授團隊采用了一種快速和簡單的替代方法，即基于Ella微流控ELISA技術(shù)的全血細胞因子釋放測定(Cytokine release assay, CRA)實驗：直接將刺激性抗原或肽添加到全血中，導致血漿中細胞因子（通常是IFN-γ）的分泌，然后進行定量。該檢測方法通過簡單地將Spike肽庫添加到全血中，可以輕松快速地檢測和相對定量接種疫苗個體中的Spike特異性T細胞反應。此方法檢測時間比常規(guī)方法縮減了7個小時，總時間縮短了12個小時。
因T細胞免疫反應在疾病的早期階段表現(xiàn)出保護作用，也可能導致致命合并癥的發(fā)生，因此COVID-19的治療和預防中需要深入地了解疾病過程中的免疫反應。特別是在癥狀輕微的患者中阻斷促炎細胞因子的早期治療干預可能會產(chǎn)生有害影響，并導致免疫反應不足和病毒清除受損。在危重COVID-19患者中恢復T細胞耗竭和改善過度炎癥反應的晚期治療干預可能具有更好的臨床結(jié)果。在疫苗開發(fā)中，也要充分考慮其是否可以增強抗病毒免疫和特定T細胞反應從而加強疫苗保護的持久性。
參考文獻：
Robust T Cell Immunity in Convalescent Individuals with Asymptomatic or Mild COVID‐19.
Highly functional virus‐specific cellular immune response in asymptomatic SARS-CoV‐2 infection.
T‐cell responses and therapies against SARS‐CoV‐2 infection.
Rapid determination of the wide dynamic range of SARS‐CoV‐2 Spike T cell responses in whole blood of vaccinated and naturally infected.
T cell immunity to SARS-CoV-2 following natural infection and vaccination.
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