MEHP刺激以HIF-1α依賴的方式導致睪丸Leydig和Sertoli細胞的鐵死亡

環(huán)境內分泌干擾物暴露會危害男性健康生殖功能。環(huán)境內分泌干擾物普遍存在于殺蟲劑和除草劑中，同時也可以通過食品包裝材料泄露于環(huán)境之中。環(huán)境內分泌干擾物可在人體組織和血液中積累，并達到穩(wěn)定濃度；有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境內分泌干擾物可模擬內分泌激素的作用，進而導致體內激素分泌、合成障礙。鄰苯二甲酸二辛酯（DEHP）是一種廣泛運用的環(huán)境內分泌干擾物，已被證明會導致男性生殖功能障礙。當下流行病學研究表明，DEHP暴露可引起男性精子質量下降。孕期DEHP暴露可誘發(fā)子代患隱睪和尿道下裂。但DEHP刺激引起睪丸細胞功能障礙的機制尚未完全探明。
             
2021年12月，重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院泌尿外科吳盛德課題組在Journal of Hazardous Materials發(fā)表了題為“Di-(2-ethylhexyl) phthalate exposure leads to ferroptosis via the HIF-1α/HO-1 signaling pathway in mouse testes”的論文。論文第一作者為吳雨昊博士研究生。

                         
一、研究思路
01 體內外驗證DEHP刺激可導致睪丸損傷。
02 組學分析與實驗驗證得出HIF-1α等信號通路出現(xiàn)異常。
03 探索HIF-1α信號通路的作用機制。
04 體外敲除HIF-1α進一步驗證HIF-1α的作用。
               
二、結果
⭐ 體內驗證DEHP刺激可導致睪丸損傷
小鼠服用DEHP后，作者通過HE染色發(fā)現(xiàn)生殖細胞脫落、細精管層數(shù)減少的現(xiàn)象，證明了DEHP可導致睪丸損傷。利用RNA-Seq，檢測服用DEHP的實驗組和未服用DEHP的對照組。經(jīng)過GO分析，發(fā)現(xiàn)差異表達的基因與氧化應激和鐵代謝相關。同時KEGG分析篩選到與鐵離子代謝相關的ferroptosis途徑和谷胱甘肽代謝途徑。通過進一步的分析，發(fā)現(xiàn)HIF-1信號通路也受到了影響。接下來，作者開展了一系列實驗，結果均與RNA-seq的分析吻合。至此，作者已經(jīng)明確：在DEHP處理后，體內亞鐵離子的濃度上升、脂質過氧化反應增強、鐵離子代謝相關的蛋白表達發(fā)生改變和HIF-1α表達增加，最終導致睪丸損傷。
                
⭐ 體外驗證MEHP刺激可加速細胞死亡
作者在體內驗證了DEHP與睪丸損傷有相關性后，接著在體外進行驗證，發(fā)現(xiàn)體外實驗的結果與體內的一致。MEHP是DEHP的主要生物代謝物，能替代DEHP用于體外實驗。作者使用MEHP作為DEHP的替代物，處理TM3間質細胞系（TM3 Leydig cell line）TM4支持細胞系（TM4 Sertoli cell line），發(fā)現(xiàn)能加速兩種細胞系的死亡。與體內實驗思路相似，將對照組和實驗組進行RNA-Seq，通過GO分析發(fā)現(xiàn)差異表達的基因與氧化應激和鐵穩(wěn)態(tài)相關。KEGG 分析也發(fā)現(xiàn)ferroptosis途徑、谷胱甘肽代謝途徑和HIF-1 信號通路受到影響。并且RNA-seq的分析結果也得到了實驗的驗證。所以，作者體外的實驗結果表明：在MEHP刺激后睪丸間質細胞和支持細胞后的ROS顯著增加、包括Hmox1等鐵離子代謝相關的基因表達模式發(fā)生改變、亞鐵例子的濃度上升和線粒體形態(tài)異常。
                  
⭐ HIF-1α 通過調控HO-1的表達影響亞鐵濃度
接著，作者開展機制探討。通過分析HIF-1信號通路相關的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)編碼 PHD 的 Egln1 、 Egln3 在 MEHP刺激后下調。而PHD 復合物通常會降解 HIF-1α，并且通過 RT-qPCR 和WB檢測也驗證 Egln1、Egln2 和 Egln3 與HIF-1α 和 HIF-1β的表達模式相反。接著通過分離了 Leydig 和 Sertoli 細胞的細胞質蛋白和核蛋白，發(fā)現(xiàn)MEHP 的刺激會影響 HIF-1α 穩(wěn)定性和積累，發(fā)現(xiàn)ME，導致 HIF-1α 從細胞質易位進入細胞核。接著通過 ChIP-qPCR 分析，發(fā)現(xiàn) HIF-1α 可以與 Hmox1 的啟動子結合，調控HO-1（由 Hmox1 編碼）的表達。最終由于HO-1的表達上調，導致亞鐵濃度上升。
                         
⭐ 體外敲除HIF-1α進一步驗證HIF-1α的作用
通過上述的一系列實驗，作者篩選到與睪丸細胞損傷相關的基因：HIF-1α，并且初步發(fā)現(xiàn)其調控機制。為了進一步確認這一結果，作者構建了 HIF-1α基因敲除的 Leydig 和 Sertoli 細胞系（HIF-1α基因敲除的 Leydig 和 Sertoli 細胞系，由賽業(yè)生物提供），用于后續(xù)的實驗。通過Sanger測序和Western blotting檢測，確認了敲除細胞系中的HIF-1α被成功敲除。在 與野生型細胞相比，HIF-1α-KO的細胞系在MEHP刺激下細胞活力受損的程度有明顯改善。同時，脂質過氧化（圖1b，I）和亞鐵超載（圖1c，J）也受到抑制。分別使用qPCR和Western印跡法評估Hmox1和HO-1水平的表達，發(fā)現(xiàn)敲除Hif-1α能逆轉MEHP刺激下的Hmox1（圖1d，K）和HO-1（圖1g，N）表達水平上調。此外，MEHP刺激后ROS爆發(fā)（圖1E，L）和細胞死亡（圖1F，M）程度也在敲除HIF-1α后減弱。Western印跡顯示敲除HIF-1α恢復了ACSL4、FTH1和SLC7A11的表達，以及抑制GPX4的表達（圖1 G，N）�？偟膩碚f，這些結果表明，MEHP刺激以HIF-1α依賴的方式導致睪丸 Leydig 和 Sertoli 細胞的鐵死亡。

圖 1 HIF-1α基因敲除挽救了MEHP誘導的鐵死亡

                            
三、總結
作者通過MEHP刺激后的表型分析、RNA-Seq分析、ChIP-qPCR 分析等發(fā)現(xiàn)與睪丸細胞功能障礙相關的調控基因：HIF-1α。并初步發(fā)現(xiàn)其調控機制：MEHP（體內DEHP的主要生物代謝物）可抑制PHDs，影響HIF-1α積累和穩(wěn)定，導致HIF-1α易位到細胞核，并誘導 Leydig 和 Sertoli 細胞中HIF-1/Hmox1結合，使HO-1的表達上調。HO-1的過表達導致亞鐵超載，ROS積累，最終導致鐵死亡，損傷Leydig 和 Sertoli 細胞的活性。這一結果，進一步在HIF-1α基因敲除的細胞系得到驗證。
                            
四、參考文獻：
Wu Y, et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate exposure leads to ferroptosis via the HIF-1α/HO-1 signaling pathway in mouse testes. 2021, 127807. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.127807​