單細(xì)胞分辨率解析脊柱退行性疾病的細(xì)胞圖譜

椎間盤中央膠質(zhì)樣部分髓核（NP）變性是椎間盤退變(IVDD)和腰背痛發(fā)生的主要原因。目前的治療方法僅限于緩解背部癥狀，這使得該病擁有極高的復(fù)發(fā)率。NP細(xì)胞(NPCs)是NP組織中分布的主要細(xì)胞類型，它們負(fù)責(zé)維持組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。NPCs增殖緩慢，缺乏自我再生能力，這增加了疾病治療的難處。目前對(duì)NPCs的病理生理學(xué)研究通常在轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組分析水平。然而，組織水平的分辨率掩蓋了細(xì)胞間和細(xì)胞類型內(nèi)改變的異質(zhì)性。

來自澳大利亞悉尼大學(xué)和昆士蘭大學(xué)以及來自河北醫(yī)科大學(xué)的研究人員在Advance Science（IF 16.8）雜志上發(fā)表了題為“Single-Cell Transcriptome Profiling Reveals Multicellular Ecosystem of Nucleus Pulposus during Degeneration Progression”的文章，該文章利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了與IVDD發(fā)展相關(guān)的細(xì)胞類群以及這些細(xì)胞間的相互作用關(guān)系，揭示了NP中NPCs型的復(fù)雜性和表型特征，從而為IVDD治療提供了新的見解和線索。

研究材料
8例不同退化程度患者的脊柱髓核組織

技術(shù)路線
· 步驟1：?jiǎn)渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建NPCs的單細(xì)胞圖譜；
· 步驟2：通過分化軌跡分析發(fā)現(xiàn)IVDD發(fā)展的關(guān)鍵NPCs細(xì)胞群；
· 步驟3：對(duì)免疫細(xì)胞群進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵免疫類細(xì)胞群；
· 步驟4：通過細(xì)胞通訊分析結(jié)果構(gòu)建以NPCs細(xì)胞為核心的細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。

研究結(jié)果
1. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建NP組織的單細(xì)胞圖譜
作者分離了8名不同程度變性的IVDD患者的NP組織用于單細(xì)胞檢測(cè)，根據(jù)高表達(dá)基因和已發(fā)表的文章對(duì)NPCs進(jìn)行鑒定注釋，共確定了6個(gè)細(xì)胞亞群。這表明NP細(xì)胞群具有較強(qiáng)的異質(zhì)性。接下來，作者分析了退化等級(jí)與細(xì)胞群類型之間的相關(guān)性。HT-CLNPs和regNPCs是II級(jí)椎間盤的主要細(xì)胞類型。effectNPCs和HT-CLNPs是III級(jí)和IV級(jí)椎間盤的主要細(xì)胞類型。對(duì)于V級(jí)椎間盤，fibroNPCs和adhesionNPCs是主要的細(xì)胞類型。此外，IVDD嚴(yán)重程度從II級(jí)到V級(jí)，伴有adhesionNPCs和fibroNPCs的比例增加，而homeostaticNPCs的比例則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。除此之外，通過轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)了 一組與退化程度相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其中包括AR、REL、LMX1A和PRDM1都是首次發(fā)現(xiàn)。而基于IVDD分級(jí)相關(guān)的差異分析，作者發(fā)現(xiàn)了一組可能促進(jìn)脊柱退性的信號(hào)通路，包括抗原加工和遞呈通路、TNF通路、MAPK通路和Hippo通路等。

圖1 人類NP組織細(xì)胞圖譜的鑒定以及與IVDD嚴(yán)重程度的相關(guān)性

2. 通過分化軌跡分析發(fā)現(xiàn)IVDD發(fā)展的關(guān)鍵NPCs細(xì)胞群
為了分析各亞群間的功能差異，對(duì)鑒定的NPCs亞群研究其生物學(xué)過程。EffectorNPCs高表達(dá)代謝相關(guān)基因（如類固醇生物合成、糖胺聚糖代謝等）。RegNPCs高表達(dá)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和內(nèi)源性刺激反應(yīng)相關(guān)的基因（如CXCL3、IL-6和CHI3L1等）。homeostaticNPCs則高表達(dá)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因（如翻譯調(diào)節(jié)、蛋白/RNA代謝等）。AdhesionNPCs則顯著富集與細(xì)胞遷移和細(xì)胞基質(zhì)黏附相關(guān)的基因。此外，作者對(duì)這些不同的NPCs進(jìn)行了分析，包括神經(jīng)分布、血管生成和細(xì)胞衰老等因素，這些都與IVDD發(fā)展相關(guān)。

接著，作者通過擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞譜系的分化軌跡，順序依次為：fibroNPCs→AdhesionNPCs→EffectorNPCs→RegNPCs→HT-CLNPCs→homeostaticNPCs。通過RNA velocity分析發(fā)現(xiàn)了同樣的分化軌跡，并且分析了fibroNPCs中一些關(guān)鍵基因（如Col14A1、CoL12a1、CHAD、CRTAC1、TNC和Lamb1等）。這些結(jié)果說明fibroNPCs具有祖細(xì)胞的特征。隨后，作者通過相關(guān)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)論，并指出在fibroNPCs未來的研究中可能是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。

圖2  單細(xì)胞揭示了NPCs的轉(zhuǎn)錄特征

圖3  分化軌跡分析揭示IVDD終末期的祖細(xì)胞類型

3. 對(duì)免疫細(xì)胞群進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵免疫類細(xì)胞群
除NPCs外，NP組織中還發(fā)現(xiàn)了免疫細(xì)胞。根據(jù)基因表達(dá)水平對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行鑒定注釋。根據(jù)高表達(dá)基因和已發(fā)表的單細(xì)胞研究，確定了9個(gè)亞群。分別為NK細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，T細(xì)胞，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞（G-GMP），中性粒細(xì)胞，B細(xì)胞，漿細(xì)胞和粒細(xì)胞髓性抑制細(xì)胞（G-MDSC）。作者分析了退化等級(jí)與細(xì)胞群類型之間的相關(guān)性，相比輕度退化的NP組織，在嚴(yán)重退化的NP組織中G-MDSCs顯著減少。并且通過實(shí)驗(yàn)，作者驗(yàn)證了這一現(xiàn)象。這些結(jié)果顯示了G-MDSCs的存在對(duì)于IVDD的發(fā)展具有保護(hù)作用。

圖4 單細(xì)胞揭示免疫類細(xì)胞的細(xì)胞圖譜

圖5  G-MDSCs的功能研究

4. 構(gòu)建以NPCs細(xì)胞為核心的細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型
由于上述的分析結(jié)果顯示NP組織由NPCs和免疫細(xì)胞組成。接下來，作者通過細(xì)胞通訊分析，對(duì)細(xì)胞間的相互作用關(guān)系進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了免疫類細(xì)胞與NPCs類之間存在廣泛的作用關(guān)系。這些作用關(guān)系主要是通過細(xì)胞間的配體和受體進(jìn)行，如VEGFA、VEGFB和VEGF受體（FLT1、ADRB2和NRP2等）。需要注意的是巨噬細(xì)胞和NPCs之間的相互作用關(guān)系可能與促進(jìn)血管生成相關(guān)。而健康的IVD大部分是無血管的，顯示這種作用關(guān)系誘導(dǎo)的血管生成在IVDD的發(fā)展過程中扮有重要作用。除此之外，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)生長(zhǎng)因子，包括TGFβ、PDGF和OSM等，這些相關(guān)因子對(duì)于NPCs的增殖具有促進(jìn)作用，這可能與NP內(nèi)環(huán)境中的免疫平衡、細(xì)胞增殖和血管生成相關(guān)。然而確切的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

圖6  免疫細(xì)胞與NPCs在IVDD中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

小編小結(jié)
作者通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了IVDD患者在退化過程中，NP組織中NPCs和免疫細(xì)胞的異質(zhì)性和表型，以及這些細(xì)胞在IVDD發(fā)展過程中的作用。發(fā)現(xiàn)了幾種與IVDD發(fā)展密切相關(guān)的細(xì)胞類型以及對(duì)應(yīng)的marker。并且通過細(xì)胞通訊分析構(gòu)建了IVDD中的細(xì)胞相互作用關(guān)系的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而為IVDD治療提供了新的見解和線索。

中科優(yōu)品推薦
【中科新生命】重點(diǎn)布局單細(xì)胞多組學(xué)平臺(tái)，先后建立了基于10x Genomics 最新Chromium X的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)以及“一站式”單細(xì)胞蛋白質(zhì)組服務(wù)平臺(tái)。其中，Chromium X作為當(dāng)前業(yè)內(nèi)通量最高的單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)之一，可以實(shí)現(xiàn)百萬級(jí)細(xì)胞通量檢測(cè)，為大規(guī)模單細(xì)胞圖譜、高通量藥物篩選、稀有細(xì)胞鑒定分析等需求提供助力。