Isoplexis 單細(xì)胞蛋白組技術(shù)助力加速免疫治療項(xiàng)目臨床前研發(fā)

免疫療法已被證明是一種很有前途的治療方法。但由于免疫相關(guān)的潛在的嚴(yán)重不良反應(yīng)，使許多研究人員依賴小鼠模型來(lái)獲得對(duì)于研究的治療產(chǎn)品或療法進(jìn)行更深入的了解。從早期研發(fā)到臨床的整個(gè)過(guò)程中，IsoPlexis的單細(xì)胞解決方案一直在這方面幫助研究人員，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)獲得與體內(nèi)活性相關(guān)指標(biāo)。

通過(guò)檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞同時(shí)分泌多個(gè)細(xì)胞因子的能力，即細(xì)胞的多功能性，檢測(cè)最有效的細(xì)胞亞群進(jìn)而建立這種聯(lián)系。對(duì)于單細(xì)胞多功能檢測(cè)，允許研究人員發(fā)現(xiàn)臨床前發(fā)展的新機(jī)制，并加速他們的研究。相比于傳統(tǒng)的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)有著很大的優(yōu)勢(shì)。

IsoPlexis單細(xì)胞蛋白組技術(shù)使用了一種綜合的評(píng)價(jià)標(biāo)尺——細(xì)胞多功能指數(shù)(PSI)，對(duì)細(xì)胞的功能進(jìn)行表征。PSI作為單細(xì)胞功能生物標(biāo)志物的新標(biāo)準(zhǔn)，可以幫助研究人員加速他們的免疫治療項(xiàng)目。

這個(gè)新解決方案運(yùn)行在IsoLight、IsoSpark和IsoSparkDuo系統(tǒng)上，與之配套的是通用的IsoCode芯片，一張芯片可分離500-1500個(gè)單細(xì)胞，進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞的分泌蛋白。獨(dú)特的條形碼技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞分泌的的多達(dá)32個(gè)細(xì)胞因子。這使得研究人員能夠深入研究細(xì)胞的功能。

IsoPlexis新的解決方案加快體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及研發(fā)進(jìn)程
使用小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)研究可能需要幾周的時(shí)間，而使用IsoPlexis平臺(tái)的研究人員可以更快地得到結(jié)果。我們來(lái)看一下兩個(gè)相關(guān)的應(yīng)用案例。

多功能GPC3CAR-T治療鼠原位肝癌
Glypican3(GPC3)是Wnt依賴性細(xì)胞增殖的抗原，在肝癌(HCC)中高表達(dá)。2020年在Gastroenterology(IF= 22.682)文章中報(bào)道，研究者利用基于人源化YP7(hYP7)和HN3抗體制備CAR-T細(xì)胞，靶向GPC3，并評(píng)價(jià)其功能。

多功能T細(xì)胞是T細(xì)胞的一個(gè)亞群，能夠在單細(xì)胞水平上共同產(chǎn)生兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞因子/趨化因子，最近有報(bào)道稱它們?cè)谂R床環(huán)境中與持久免疫反應(yīng)相關(guān)。研究者使用IsoPlexis的單細(xì)胞蛋白組技術(shù)對(duì)制備的CAR-T進(jìn)行了功能評(píng)價(jià)。使用能夠同時(shí)檢測(cè)32中關(guān)鍵的T細(xì)胞免疫因子的芯片對(duì)CAR-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，比較了CAR（HN3）T細(xì)胞或CAR(hYP7)T細(xì)胞的多功能性，與Mock對(duì)照組相比，CAR(hYP7)T細(xì)胞能夠分泌多種因子的細(xì)胞比例更高，表現(xiàn)出更強(qiáng)的多功能性，提示可能有著更強(qiáng)的功能、更好的治療效果（圖1）。
 

圖1：Heatmap圖顯示hYP7CAR-T細(xì)胞中表現(xiàn)出更強(qiáng)的多功能性

在之后的小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，研究者在NOD/SCID/IL-2Rgc^null(NSG)小鼠腹腔注射表達(dá)熒光素酶的Hep3B或HepG2細(xì)胞，在腫瘤形成后，小鼠注射生理鹽水或未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞（Mock），或不同劑量的CAR（HN3）T細(xì)胞或CAR(HYP7)T細(xì)胞。結(jié)果顯示，在CAR（HN3）T細(xì)胞處理的小鼠中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤生長(zhǎng)抑制。接受20M CAR (hYP7) T細(xì)胞治療的小鼠在第70天均存活，沒(méi)有復(fù)發(fā)。接受hYP7CAR-T細(xì)胞注射的小鼠的治療效果更好（圖2）。
 

圖2：對(duì)照與多種劑量不同CAR-T組效果對(duì)比

基于APRIL三聚體（TriPRIL）設(shè)計(jì)的CAR-T細(xì)胞靶向治療多發(fā)性骨髓瘤

2019年BloodAdvances雜志上題為《RationalDesign of a Trimeric APRIL-Based CAR Binding Domain Enables EfficientTargeting of MultipleMyeloma》的文章中，研究者發(fā)表了基于APRIL三聚體的CAR結(jié)合域的合理設(shè)計(jì)靶向多發(fā)性骨髓瘤的研究進(jìn)展。

在多發(fā)性骨髓瘤的治療和研究中，CAR-T細(xì)胞治療提供了新的治療路徑，其中靶向B細(xì)胞成熟抗原(BCMA)的CAR-T細(xì)胞治療是迄今為止最有希望的治療方式，但其療效仍然存在挑戰(zhàn)，因?yàn)樵趩翁禺愋钥笲CMACAR-T細(xì)胞治療的選擇壓力下，會(huì)出現(xiàn)BCMA抗原逃逸變異，從而導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，因此仍需要不斷改進(jìn)CAR-T細(xì)胞以改善多發(fā)性骨髓瘤的療效。

在這里研究者證實(shí)了基于APRIL三聚體的新型CAR（圖3）能有效地靶向BCMA陽(yáng)性和BCMA陰性的多發(fā)性骨髓瘤。雙特異性、基于三聚體APRIL的CAR是一種很有前途的治療多發(fā)性骨髓瘤的方法，有可能預(yù)防和治療BCMA抗原逃逸。
 

圖3：APRIL和TriPRIL CARs設(shè)計(jì)

研究者將對(duì)照T細(xì)胞（UTD）、BCMA、APRIL和TriPRILCAR-T同表達(dá)BCMA和TACI的靶細(xì)胞一起培養(yǎng)，靶細(xì)胞會(huì)刺激T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，使用IsoPlexis檢測(cè)32種細(xì)胞分泌蛋白的條形碼芯片捕獲T細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子。相對(duì)于其它實(shí)驗(yàn)組，TriPRILCAR-T組細(xì)胞中的多功能細(xì)胞的比例顯著提高（圖4），單細(xì)胞分析表明，CD4+和CD8+T細(xì)胞主要分泌效應(yīng)型細(xì)胞因子，在不同的CAR-T中細(xì)胞因子分泌譜相似，但分泌頻率有顯著差異（圖5）。
 

圖4：?jiǎn)渭?xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)不同CAR-T的多功能細(xì)胞比例
 

圖5：?jiǎn)渭?xì)胞水平表征分泌因子圖譜

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，在BCMA陽(yáng)性小鼠腫瘤模型中，BCAM和TriPRILCAR-T的治療效果都是很好的；在BCMA陰性小鼠腫瘤模型中，因?yàn)槟[瘤抗原逃逸，只有TriPRILCAR-T取得了很好的治療效果（圖6）。
 

圖6：小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果，TriPRILCAR-T有效靶向BAMA陽(yáng)性和陰性的多發(fā)性骨髓瘤。

SchmidtsA , Ormhj M , Choi B D , et al. Rational design of a trimericAPRIL-based CAR-binding domain enables efficient targeting ofmultiple myeloma - ScienceDirect[J]. Blood Advances, 2019.

總結(jié)：
 

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)輒需要數(shù)個(gè)星期，甚至如第一個(gè)實(shí)驗(yàn)，需要持續(xù)70天；單細(xì)胞蛋白組技術(shù)在一周內(nèi)即可完成細(xì)胞功能的表征。應(yīng)用于體內(nèi)療效相關(guān)性分析時(shí)，單細(xì)胞蛋白組技術(shù)體現(xiàn)了以下特點(diǎn)：