全自動病毒熒光檢測分析系統(tǒng)在慢病毒載體制備中的應(yīng)用

    在基因治療領(lǐng)域，慢病毒載體(Lentivirus)是一種復(fù)制較慢的逆轉(zhuǎn)錄病毒，由HIV-1改造而來，常作為基因治療的載體使用。

    慢病毒載體的制備流程需要對病毒的物理滴度和感染滴度進行檢測。

    1. 現(xiàn)有的檢測手段（如p24 ELISA）因病毒中p24蛋白的含量不同、含有p24蛋白的雜質(zhì)（如外泌體）等因素的影響，無法精準(zhǔn)地表征病毒的物理滴度，且此類方法均無法對空載病毒（無p24蛋白）進行表征，這就給感染滴度的檢測帶來了誤差。

    2. 在復(fù)雜的病毒工業(yè)化制備流程中，只測量末端純化產(chǎn)品的滴度，無法真實反映各個生產(chǎn)環(huán)節(jié)的生產(chǎn)效率，而對各個生產(chǎn)環(huán)節(jié)的樣品都進行純化表征會浪費大量人力物力。目前研究者亟需一種無純化、快速、檢測下限低的病毒表征手段。

    3. 目前的病毒表征手段，均無法將病毒的物理參數(shù)如粒徑(與載體聚合相關(guān))與蛋白質(zhì)組分析聯(lián)系起來。因此，這些技術(shù)無法分析病毒滴度受樣品聚集或病毒破裂與分解影響的情況，因此無法區(qū)分單分散制劑與聚集樣品。
    對于上述問題，美國NanoView公司所開發(fā)的全自動病毒熒光檢測分析系統(tǒng)是一款無需純化的、全自動的可對病毒進行表征分析的全新設(shè)備。該設(shè)備能夠提供全方位的病毒表征信息，包括病毒粒徑、病毒表面和內(nèi)部病毒蛋白、病毒物理滴度、空載比檢測、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及假型定量表征等。操作簡單，結(jié)果可靠。

    全自動病毒熒光檢測分析系統(tǒng)的基本原理是一種基于特異性免疫捕獲技術(shù)，允許研究者直接分析特定群體的病毒。通過配套的試劑盒，客戶一次性能夠分析多達16個不同的樣本，大大節(jié)省了時間和經(jīng)濟成本。

    和傳統(tǒng)的病毒表征手段相比，全自動病毒熒光檢測分析系統(tǒng)有如下優(yōu)勢：

 

• 無需純化

    NanoView的LentiView™技術(shù)可以對慢病毒進行檢測，將蛋白質(zhì)組信息與物理病毒滴度結(jié)合起來，無需樣品純化。只需 35 µl 未純化或純化的樣品，檢測濃度低至106VP/ml。無需擔(dān)心純化帶來的誤差，更精確地測量樣品間的表征和表達信息的差異。

慢病毒示意圖

• 全方位的病毒粒徑分析

全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)能夠?qū)?gt;20 nm的病毒進行全方面的表征，無論是粒徑分布、空載病毒與完整病毒的假型分析均可在一次測試中得到。并且所用來測試的樣本無需進行純化，避免因純化帶來的樣本偏差。

• 病毒滴度

病毒物理滴度的最常用檢測方法是p24 ELISA。該方法測量p24衣殼蛋白的濃度并將其轉(zhuǎn)化為病毒物理滴度。樣品中溶解的p24、不同病毒p24含量的不同以及病毒聚集會影響檢測準(zhǔn)確性。此外， p24 ELISA無法檢測缺少衣殼(空載)的顆粒。LentiView™可對樣品中病毒進行高靈敏度的定量檢測，獲得滴度數(shù)據(jù)，區(qū)分完整和空載病毒并識別樣品中雜質(zhì)如可能經(jīng)過純化帶有的外泌體等。

    紅色熒光抗體標(biāo)記病毒的內(nèi)部p24衣殼蛋白，用藍色熒光抗體標(biāo)記VSV-G，同時表達p24和VSV-G的病毒顯示粉紅色，并由 NanoView專用軟件計數(shù)。

• 完整/空載病毒顆粒的比例

    NanoView的LentiView™技術(shù)可以簡單快速地分析出完整/空載病毒顆粒的比例，區(qū)分完整(成功轉(zhuǎn)導(dǎo))和空載病毒并識別樣品中雜質(zhì)，而完整/空載病毒顆粒的比例是確定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的主要依據(jù)。

 

 

    完整病毒是表達VSV-G和/或ETL，且表達衣殼蛋白p24的病毒顆粒，空載病毒是表達VSV-G和/或ETL，未表達衣殼蛋白p24的病毒顆粒

    LentiView™芯片表面固定的抗VSV-G抗體捕獲病毒后，即可檢測表面和內(nèi)部蛋白標(biāo)記物。在LentiView™獲得熒光圖像中，綠色熒光點代表沒有衣殼的VSV-G+病毒顆粒，黃色熒光點代表含有衣殼的完整病毒顆粒。

• 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

    我們使用LentiView™對三種不同的慢病毒樣品進行了表征，檢測病毒顆粒亞群，進而研究這些載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。三種不同的慢病毒樣品分別為野生型慢病毒 (VSV wt)、含高濃度質(zhì)粒的工程化靶向配體 (ETL-HC)、含低濃度質(zhì)粒的工程化靶向配體 (ETL-LC)。

三種慢病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與物理滴度的對比

    根據(jù)病毒碎片粒徑和病毒粒徑的差別，對每一種載體中的病毒和病毒碎片數(shù)量進行統(tǒng)計。50nm以上的病毒與50nm以下的病毒碎片的比例和載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率之間存在很強的相關(guān)性。

載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和病毒與病毒碎片比例的對比

• 完全定制化

    客戶通過ViroFlex技術(shù)使用連接蛋白連接任意定制化的捕獲抗體，并結(jié)合到ViroFlex芯片表面進而捕獲所需的病毒，在自己的實驗室里輕松進行高度定制化的檢測。

ViroFlex的芯片捕獲抗體排布示意圖

ViroFlex定制化檢測原理：

• 先將連接蛋白與所需的定制抗體連接

• 再將連接抗體的連接蛋白與ViroFlex芯片表面的連接蛋白抗體連接

• 所需的定制抗體從而結(jié)合到了芯片上

• 將樣品在芯片上孵育，定制抗體即可特異性捕獲病毒

• 每個芯片最多可結(jié)合兩種定制化捕獲抗體

ViroFlex芯片的捕獲原理(左)與普通芯片的捕獲原理(右)示意圖

ExoViewTM參數(shù)信息：

• 顆粒大小分辨范圍：20nm

• 最低檢測濃度為106 VP/mL

• 所需樣本體積：35 μL

• 激發(fā)波長：410 nm，488 nm，555 nm，640 nm，750nm

• 可一次檢測16個樣本，每個樣本可同時檢測6個不同亞型及4種生物標(biāo)記的熒光定位

• 捕獲抗體：一個芯片最多允許6種捕獲抗體（+陰性對照）

• 熒光通道：4個熒光通道

相關(guān)產(chǎn)品
1、全自動外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)
http://www.tenergyglobal.com/show1equip.asp?equipid=574686
2、ExoView外泌體全面表征試劑盒
http://www.tenergyglobal.com/show1equip.asp?equipid=4839430