全新外泌體內(nèi)容物檢測(cè)技術(shù)助力治療嬰兒早產(chǎn)藥物研發(fā)取得重要進(jìn)展

   外泌體內(nèi)容物包含蛋白質(zhì)、RNA、DNA和脂類(lèi)，可被用于藥物傳遞系統(tǒng)與疾病的新型診斷標(biāo)志物，具有重要的研究意義。但傳統(tǒng)的技術(shù)方法如Western Blot，ELISA，無(wú)法獲得單個(gè)外泌體的蛋白表型，更不能將檢測(cè)內(nèi)容物與粒徑分析、濃度分析、計(jì)數(shù)等聯(lián)系起來(lái)，極大地制約了外泌體內(nèi)容物的相關(guān)研究。單外泌體表征分析（Exoview）首先利用免疫識(shí)別將特定的外泌體進(jìn)行捕獲分離，然后再對(duì)目標(biāo)外泌體的表面標(biāo)志物及內(nèi)容物（如攜帶的蛋白質(zhì)、RNA、DNA及細(xì)胞因子）進(jìn)行定量分析，從而更加全面地反映外泌體內(nèi)容物的特性。近日，《Life》期刊刊登了Kammala等人的最新研究成果，該團(tuán)隊(duì)使用全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng) Exoview檢測(cè)胎膜和胎盤(pán)外泌體的內(nèi)容物，來(lái)研究母胎界面的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)。

Exoview檢測(cè)流程：

    早產(chǎn)是一種發(fā)生率極高的產(chǎn)科疾病，據(jù)估計(jì)，每年有1500萬(wàn)名嬰兒出生過(guò)早，即每10名嬰兒中就超過(guò)一人。早產(chǎn)兒的死亡率很高，每年大約有100萬(wàn)名嬰兒死于早產(chǎn)并發(fā)癥，許多存活下來(lái)的兒童也要面臨終生殘疾，包括學(xué)習(xí)障礙和視力、聽(tīng)力問(wèn)題。直至今日，由于研究結(jié)果的不同，自發(fā)性早產(chǎn)的治療方法也各不相同。由于孕期的獨(dú)特生理環(huán)境會(huì)導(dǎo)致藥代動(dòng)力學(xué)的改變以及孕期藥物治療的倫理限制，進(jìn)而導(dǎo)致治療過(guò)程無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化。

    近期，研究人員發(fā)現(xiàn)胎膜（FM）和胎盤(pán)（PLA）能夠表達(dá)多種藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。由于胎膜具有保護(hù)作用，也有可能能夠控制轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)。Kammala等^[1]研究了一種與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)在胎膜上的表達(dá)，以及在不同的胎膜細(xì)胞分泌的外泌體中是否含有BCRP，從而促進(jìn)母胎界面的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖1 (A) BCRP在胎膜和胎盤(pán)的表達(dá)；(B) BCRP在胎膜和胎盤(pán)的IHC圖像；(C) 胎膜和胎盤(pán)的BCRP蛋白表達(dá)水平。

圖2 (A) 使用流式細(xì)胞儀測(cè)定在不同細(xì)胞BCRP的表達(dá)水平；(B) 不同細(xì)胞的熒光強(qiáng)度對(duì)比；(C) 不同細(xì)胞的BCRP蛋白水平。

圖3 eFFlux熒光外流法檢測(cè)BCRP功能性，BCRP被抑制后會(huì)導(dǎo)致熒光染料被排出細(xì)胞。(A) 不同細(xì)胞經(jīng)BCRP抑制后的熒光計(jì)數(shù)對(duì)比；(B) 以熒光強(qiáng)度表示不同細(xì)胞的藥物耐受性。

    由圖1-圖3中的各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果可知，BCRP可在胎膜的多種細(xì)胞中表達(dá)，以胎盤(pán)絨毛膜癌細(xì)胞(BeWo)作為對(duì)照，其中絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞(CTC)的BCRP表達(dá)要高于BeWo；不同胎膜細(xì)胞均可在不同程度上控制藥物轉(zhuǎn)運(yùn)�；�于以上結(jié)果，研究組選擇提取CTC和BeWo分泌的外泌體，并使用Exoview進(jìn)行了外泌體表型分析。

圖4 (A)CTC與BeWo兩種細(xì)胞來(lái)源外泌體表面BCRP+的占比；(B) 兩種外泌體內(nèi)容物BCRP+的占比；(C) CTC來(lái)源外泌體內(nèi)容物BCRP熒光染色圖像；(D) BeWo來(lái)源外泌體內(nèi)容物BCRP熒光染色圖像。

    由計(jì)數(shù)結(jié)果可知，無(wú)論是來(lái)源于哪種細(xì)胞，亦或是位于外泌體表面還是內(nèi)部，BCRP與CD63的共表達(dá)均高于CD81和CD9；兩種來(lái)源的外泌體中，BCRP更多作為內(nèi)容物由外泌體進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，BeWo來(lái)源外泌體中含BCRP內(nèi)容物的外泌體占比約為CTC來(lái)源外泌體的兩倍（圖A&B）。

    研究組首次發(fā)現(xiàn)了CTC和BeWo細(xì)胞以外泌體內(nèi)容物的形式轉(zhuǎn)運(yùn)BCRP。先前的研究發(fā)現(xiàn)，含CD63的外泌體可將跨膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至管腔內(nèi)囊泡中，而藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也是一種跨膜蛋白，可以被轉(zhuǎn)運(yùn)至特定的組織發(fā)揮作用。胎膜細(xì)胞可通過(guò)含有BCRP的外泌體，以旁分泌的形式使其他細(xì)胞獲得藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，影響特定組織的環(huán)境。通過(guò)這項(xiàng)新發(fā)現(xiàn)，改變現(xiàn)有的產(chǎn)科藥理學(xué)，可以開(kāi)發(fā)以BCRP+外泌體，尤其是CD63+/BCRP+的外泌體作為靶標(biāo)的新型靶向藥物，有效提高藥物轉(zhuǎn)運(yùn)能力，降低早產(chǎn)的發(fā)生率，減輕孕期用藥的不良反應(yīng)，改善現(xiàn)有的孕期治療方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kammala,   A., Benson, M., Ganguly, E., Radnaa, E., Kechichian, T., Richardson, L.,   & Menon, R. (2022). Fetal Membranes Contribute to Drug Transport across   the Feto-Maternal Interface Utilizing the Breast Cancer Resistance Protein   (BCRP). Life, 12(2), 166.

全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)（ExoView R100）簡(jiǎn)介

    作為外泌體表征分析的倡導(dǎo)者，美國(guó)NanoView Biosciences于2018年推出了全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)ExoView，該系統(tǒng)一經(jīng)推出，便引起了外泌體領(lǐng)域科研工作者的廣泛關(guān)注，憑借其穩(wěn)定、出色的性能，短短幾年在全球已有近百個(gè)客戶(hù)，發(fā)表文獻(xiàn)100多篇。ExoView的精準(zhǔn)表征，能夠幫助科學(xué)家更深入地了解外泌體與疾病之間的關(guān)系，助力疾病診斷和新藥開(kāi)發(fā)。

    Nanoview所開(kāi)發(fā)的全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)（ExoView R200）采用單粒子干涉反射成像傳感器（SP-IRIS）技術(shù)，是一款無(wú)需純化的全自動(dòng)的新型外泌體表征設(shè)備。該設(shè)備能夠提供全方位的外泌體表征信息，包括顆粒大小、計(jì)數(shù)、表型與生物標(biāo)志物共定位等，提供多層次和全面的外泌體測(cè)量解決方案。

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