染料探針應用：靶向EGFR的NIR-II染料納米探針用于口腔癌診斷治療

瀏覽次數(shù)：850　發(fā)布日期：2022-5-17　來源：恒光智影

本文要點：口腔癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，手術(shù)聯(lián)合放化療是主要治療方式。然而，可能導致手術(shù)后復發(fā)的陽性切緣一直是需要解決的關(guān)鍵問題。此外，放化療也存在對化療和放療耐藥、缺乏靶向性、副作用嚴重等缺點。因此，探索腫瘤手術(shù)導航和腫瘤治療的新方法對口腔癌具有重要意義。盡管新興的近紅外 II（NIR-II，1,000–1,700 nm）區(qū)域熒光成像已經(jīng)徹底改變了手術(shù)導航，但仍然缺乏高腫瘤靶向熒光探針。此外，新興的光熱療法（PTT）雖然可以克服放化療的缺點，實現(xiàn)腫瘤的精準治療，但由于缺乏高光熱轉(zhuǎn)換效率、高光熱穩(wěn)定性和高穿透性材料，其臨床應用仍受到限制。在此，開發(fā)了一種用于口腔癌腫瘤成像和 PTT 的 NIR-II 染料 SQ890。SQ890 NPs-Pep通過組裝成納米顆粒（NPs）并用靶向上皮生長因子受體（EGFR）的肽GE11進行修飾，可以通過主動靶向在腫瘤部位特異性蓄積，實現(xiàn)光聲/NIR-II熒光雙模態(tài)成像- 指導口腔癌的PTT。

光熱療法（PTT）作為一種非侵入性治療方法，因其毒性低、耐藥性小、副作用少、腫瘤破壞效率高等優(yōu)點而備受關(guān)注。通過使用腫瘤靶向技術(shù)，光熱轉(zhuǎn)換劑 (PTA) 在腫瘤部位聚集，并在暴露于 NIR 光時將光能轉(zhuǎn)化為熱能以殺死癌細胞。此外，PTA 可用于光聲和熒光 (FL) 成像以及 PTT 。在近紅外光照射下，腫瘤部位的PTA將激光轉(zhuǎn)化為超聲波和熒光信號，可有效定位腫瘤組織并顯示腫瘤邊界，為腫瘤的完全切除提供相對客觀的參考。在本文中，我們合成了一種 NIR-II 染料 SQ890。通過引入強電子供體基團，擴展π共軛體系，形成供體-受體-供體剛性平面共振結(jié)構(gòu)，SQ890的熒光發(fā)射波長擴展到NIR-II窗口，提高了組織穿透性深度，并產(chǎn)生更高的信噪比和更好的空間和時間分辨率，在影像引導切除和腫瘤診斷中顯示出巨大的應用潛力。此外，SQ890 在 890 nm 處表現(xiàn)出強吸收和高光熱轉(zhuǎn)換效率，這對于腫瘤的光聲成像和光熱治療都是理想的。由于上皮生長因子受體 (EGFR) 是腫瘤治療靶點之一，特別是在口腔癌中過表達，因此 SQ890用DSPE-PEG5K-COOH 封裝在納米顆粒 (NPs) 中，并用 EGFR 靶向多肽修飾以實現(xiàn)精確的腫瘤部位靶向。SQ890 NPs-Pep由于主動靶向和增強的通透性和保留（EPR）效應而特異性聚集在腫瘤部位，實現(xiàn)了腫瘤的熒光和光聲雙模態(tài)成像，為腫瘤切除提供視覺指導，并有效同時消融腫瘤組織，在口腔癌的診斷和治療中顯示出廣闊的前景。

SQ890的最大吸收峰在890 nm, Q890在808 nm激光照射下表現(xiàn)出顯著的濃度和激光密度依賴性溫度升高。在10μM的低相對濃度下，SQ890在輻照下5分鐘內(nèi)已經(jīng)達到約 43℃的致死溫度，較高的濃度和激光功率密度提供了較高的溫度升高，如圖1（b）和1（c）。此外，與吲哚菁綠(ICG) 相比，SQ890 出色的光穩(wěn)定性在五個激光開關(guān)加熱循環(huán)后得到驗證，沒有出現(xiàn)溫度變化（圖1e）。根據(jù)圖 1(f) 所示的熱轉(zhuǎn)換時間常數(shù)和最大穩(wěn)態(tài)溫度，計算出 SQ890 的光熱轉(zhuǎn)換效率約為 59%，這對于腫瘤消融是理想的。除了光熱特性外，令人鼓舞的是，SQ890 在 NIR-II 窗口中表現(xiàn)出良好的熒光性能，量子產(chǎn)率為 0.26%。SQ890 的熒光光譜顯示最大發(fā)射波長約為 980 nm，并擴展到 1,400 nm（圖 1（g））。并且，如圖 1(h) 所示，SQ890 的熒光強度在照射 10 分鐘后顯示出可忽略不計的變化。

為了進一步的生物醫(yī)學應用，將SQ890與DSPE-PEG5K-COOH通過納米沉淀法組裝成納米顆粒（SQ890 NPs-Pep），然后連接EGFR靶向肽配體構(gòu)建SQ890 NPs-Pep以實現(xiàn)腫瘤特異性靶向。并且通過上述方法用DSPE-mPEG5K制造了非靶向納米顆粒（SQ890 NPs）。然后通過動態(tài)光散射 (DLS) 和透射電子顯微鏡 (TEM) 檢測 SQ890 NPs 和 SQ890 NPs-Pep 的形態(tài)和尺寸，結(jié)果顯示均勻的球形顆粒形狀為 ~ 144 nm 和 ~ 157 nm，具有良好的分散性（圖1i、1j）。SQ890 NPs和SQ890 NPs-Pep的電勢分別為–17 mV and –10 mV，表明通過 EPR 效應在腫瘤部位積聚。

圖 1：SQ890 和 SQ890 NPs 的表征。(a) SQ890（在二甲亞砜 (DMSO) 中）和 NPs 水溶液的歸一化吸收光譜。(b) 不同濃度的 SQ890 分散體在 808 nm 激光 (1 W·cm-2) 照射 6 分鐘后的溫度曲線。(c) 不同功率的 808 nm 激光照射下 SQ890 在 DMSO (40 μM) 中的溫度曲線。(d) 808 nm 激光照射 5 分鐘后不同濃度 SQ890 的紅外熱成像。(e) SQ890 和 ICG 五個周期的光穩(wěn)定性測試。 (f) SQ890 (40 μM) 在 808 nm 照射下的光熱性能。插圖顯示了線性時間數(shù)據(jù)與從冷卻期獲得的 -lnθ。(g) SQ890（溶解在 DMSO 中）在 808 nm (1 W·cm-2) 照射 10 分鐘后的熒光強度變化。(h) SQ890 在 808 nm (1 W·cm-2) 照射下 10 分鐘的 NIR II FL 圖像。(i) SQ890 NPs-Pep 和 SQ890 NP (j) 的尺寸分布。插圖：TEM 圖像。(k) NPs 的 Zeta 電位.(l) NPs 在 4 °C下儲存 40 天后的穩(wěn)定性

使用上述方法將羅丹明 B(Rho B) 封裝到 NPs 中，有或沒有靶向配體，以檢查配體的靶向性。用 Rho B NPs 或 Rho B NPs-Pep 處理高表達 EGFR 的 CAL 27 細胞和低表達 EGFR 的 L-02 細胞 4 h，并通過共聚焦激光掃描顯微鏡 (CLSM) 和流式細胞儀檢測細胞對 NPs 的攝取。如圖 2(a) 所示，Rho B NPsPep 被 CAL 27 細胞顯著內(nèi)化并發(fā)出最強的紅色熒光。相反，當 EGFR 被阻斷或低表達時，Rho BNPs-Pep 的內(nèi)化減少并顯示出微弱的紅色熒光。同時，用 Rho B NPs 處理的 CAL 27 細胞在缺乏靶向性的情況下表現(xiàn)出低細胞攝取。定量流式細胞術(shù)分析也提供了類似的結(jié)果（圖 2（b）和 2（c））。這些結(jié)果表明，具有靶向配體的 NPs 結(jié)合 EGFR 并觸發(fā)受體介導的內(nèi)吞作用，促進納米顆粒的攝取并確認配體的靶向性。MTT證實了納米顆粒在濃度達到顯示輕微的40 μM的時候幾乎沒有毒性，證實了其良好的生物安全性（圖2d）。此外，流式細胞儀用于確認 PTT 的效果。如圖所示。如圖2（f）和2（g）所示，用NPs和808 nm激光處理的聯(lián)合治療組細胞凋亡率最高，而單藥治療組細胞存活率超過90%，這與MTT檢測結(jié)果一致。

圖 2：CAL 27 細胞的細胞內(nèi)化和細胞毒性。(a) 通過 CSLM 觀察到的 Rho B 標記的 NP 的細胞攝取（CAL27 和 L-02 細胞），比例尺：10 μm。(b) 通過流式細胞術(shù)對細胞內(nèi)NPs 進行定量分析。(c) 細胞內(nèi) NPs 平均 Rho B 強度的定量分析。(d) CAL 27 細胞與不同濃度的 SQ890 NPs 或 SQ890 NPs-Pep 在有或沒有 808 nm 激光照射的情況下孵育的活力。(e) CAL 27 細胞在各種處理后的活/死圖像，用 PI 和 calcein AM 染色，比例尺：100 μm。(f) 活細胞、凋亡細胞和壞死細胞的定量分析。(g) 通過流式細胞術(shù)分析各種處理后CAL 27 細胞凋亡的膜聯(lián)蛋白 V-FITC/PI染色

由于其光熱特性，SQ890 有望成為 PAI 的理想試劑。然后進行體內(nèi) PAI 以研究 SQ890 NPs-Pep 作為 PAI 試劑。為此，將 CAL 27 荷瘤小鼠分為 3 組，分別給予 SQ890 NPs（被動靶向）、SQ890 NPs-Pep（主動靶向）和 EGFR 肽+SQ890 NPs Pep（阻斷）給藥。在注射后 0、2、4、8、12 和 24 小時監(jiān)測 PA 信號，并通過 ImageJ 測量。如圖3（a）所示，在所有3組中都可以清楚地看到PA信號，然而，活性靶向組中的SQ890 NPs-Pep首先在4小時時在腫瘤部位達到最大積累并表現(xiàn)出最強的PA信號，另一方面，來自阻斷組和被動組的納米顆粒僅通過 EPR 效應在腫瘤部位積累，并顯示出相對較弱的最大 PA 信號，隨后在 8 小時出現(xiàn)。圖 3(b) 顯示了 PA 信號的半定量分析，驗證了 SQ890 NPs Pep 作為 PAI 和腫瘤特異性靶向的顯著試劑。

CAL 27荷瘤小鼠的NIR-II FL成像在用上述方法處理后記錄。然而，主動靶向組在 4 h 時表現(xiàn)出最強的 FL 信號，而其他兩組的 FL 信號在 8 h 時達到峰值（圖3c、3d、3e）。

圖 3：體內(nèi)成像研究。（a）PA圖像和（b）在各種治療后的指定時間點獲得的腫瘤的相對信號強度。(c) 體內(nèi) NIR II FL 成像和 (d) 各種處理后不同時間點相對熒光強度的半定量分析。(e) 腫瘤切除術(shù)前和術(shù)后。

在患有皮下 CAL 27 腫瘤的小鼠中探索了體內(nèi)殺腫瘤功效。將小鼠隨機分為七組（n = 5）：磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）與激光（空白）、SQ890、SQ890 NPs、SQ890 NPs-Pep、SQ890 與輻照（SQ890+L）、SQ890 NPs 與輻照（SQ890 NPs+L) 和 SQ890 NPs-Pep 輻照 (SQ890 NPs-Pep+L)。在 5 分鐘內(nèi)，SQ890 NPs+L 和 SQ890 NPs-Pep+L 組的腫瘤區(qū)域分別達到了 53.9 和 59.6℃的治療溫度。而用 SQ890 和 PBS 處理的小鼠的溫度分別溫和升至45.9 和 38.2℃（圖4a、4b）。與空白組相似，沒有光照的小鼠的腫瘤體積在 14 天后大大增加。而在SQ890 NPs+L 和 SQ890NPs-Pep+L 組中腫瘤幾乎消退，在SQ890+L 組中受到一定程度的抑制（圖4c-e）。H&E和TUNEL染色的腫瘤活檢顯示激光治療組的腫瘤細胞凋亡（圖 4g），表明治療效果明顯。圖4（f）顯示在整個治療過程中任何組的體重都沒有顯著變化。所有生化參數(shù)（肌酸激酶-MB（CK-MB）、尿酸（UA）、肌酐（CREA）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST））均正常（圖4（h）），表明對小鼠的副作用可以忽略不計。

圖 4：體內(nèi)治療研究。(a) 紅外熱成像和 (b) 不同組小鼠在 808 nm 激光照射 (1 W·cm-2) 下不同時間間隔的相應溫度升高。 (c) 每組 CAL 27 腫瘤小鼠的腫瘤體積增長 (***P < 0.001)。(d) 治療14天后不同組切除腫瘤的圖片。(e) 各種治療的腫瘤重量 (***P < 0.001)。(f) 14天治療期間小鼠的體重。(g) 不同組腫瘤的 H&E和TUNEL 染色圖。比例尺：20 μm。(h) 小鼠的血液生化分析。檢查的參數(shù)包括 CK MB、AST、ALT、UA 和 CREA。

總之，作者合成了一種NIR-II 染料 SQ890，可用于 NIR 光熱療法和光聲/NIR II 熒光雙模態(tài)成像。SQ890 隨后被組裝成具有 DSPE mPEG5K 的水分散性 NP，并用 EGFR 靶向肽 GE11進行功能化，以特異性識別腫瘤細胞，補充 EPR 效應提供的區(qū)域積累。實驗結(jié)果表明，SQ890 NPs-Pep 具有良好的 NIR PA/NIR-II FL 成像能力，可指導精確的癌癥治療學和體外和體內(nèi)的高 PTT 功效�？傊�，SQ890NPs-Pep 有望成為一種用于腫瘤成像、診斷和治療的新型 NIR 光療劑。

參考文獻

https://doi.org/10.1007/s12274-022-4239-0

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