Cell：Inscopix新發(fā)現(xiàn)--中腦調(diào)控運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象對(duì)帕金森癥的新啟示

運(yùn)動(dòng)對(duì)于所有生物個(gè)體都十分重要，從動(dòng)物基本的覓食行為，到躲避天敵的逃跑行為，這些都受到大腦神經(jīng)環(huán)路的支配，那么是否還有很多關(guān)于大腦調(diào)控運(yùn)動(dòng)的未解之謎呢？
科研發(fā)現(xiàn)神經(jīng)環(huán)路控制身體運(yùn)動(dòng)和協(xié)調(diào)四肢的位置起到十分重要的作用，對(duì)于帕金森病也有著十分重要的意義。

中腦運(yùn)動(dòng)區(qū)（MLR）以前被認(rèn)為只控制脊椎動(dòng)物的行走和其他形式的運(yùn)動(dòng)，近期由瑞士巴塞爾大學(xué)Friedrich Michel生物醫(yī)學(xué)研究所和生物中心發(fā)表在Cell上的題為“Functional diversity for body actions in the mesencephalic locomotor region.”的文章，在這項(xiàng)對(duì)小鼠的研究中，發(fā)現(xiàn)中腦運(yùn)動(dòng)區(qū)也調(diào)節(jié)姿勢(shì)變化和其他運(yùn)動(dòng)。這項(xiàng)新研究通過使用Inscopix自由行為顯微鈣成像系統(tǒng)觀察中腦運(yùn)動(dòng)區(qū)（MLR）神經(jīng)元不同群體的興奮性發(fā)現(xiàn)兩種在空間上混雜的谷氨酸能群體——一種連接脊髓，一種連接基底神經(jīng)節(jié)。這項(xiàng)新的研究表明，那些直接連接到脊髓的細(xì)胞參與調(diào)節(jié)身體伸展和姿勢(shì)變化，這可能是啟動(dòng)運(yùn)動(dòng)所必需的，還可能對(duì)緩解藥物無效的帕金森病患者的姿勢(shì)和步態(tài)問題具有啟示意義。
正文

運(yùn)動(dòng)對(duì)于所有物種的生存都至關(guān)重要，是整個(gè)身體的地面移動(dòng)的方法。它使人們能夠與環(huán)境進(jìn)行多種形式的可控互動(dòng)，包括探索，如尋找食物，以及應(yīng)對(duì)緊急的反應(yīng)，如逃離危險(xiǎn)。無論選擇何種運(yùn)動(dòng)形式，其成功完成都需要整個(gè)身體進(jìn)行受控的姿勢(shì)調(diào)整，協(xié)調(diào)四肢以實(shí)現(xiàn)身體的轉(zhuǎn)移，以及有效抑制與運(yùn)動(dòng)不相容的其他肢體動(dòng)作。這些行為觀察提出了一個(gè)現(xiàn)象，即涉及運(yùn)動(dòng)和其他形式身體運(yùn)動(dòng)的選擇和調(diào)節(jié)的潛在神經(jīng)元環(huán)路機(jī)制。
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中腦運(yùn)動(dòng)區(qū)域(MLR)通過整合了許多輸入的信息并投射到下行和上行的靶點(diǎn)，結(jié)合了運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)的各種重要屬性。MLR的歷史定義是功能性的，對(duì)它的電刺激可以引發(fā)全身運(yùn)動(dòng)，速度和步態(tài)隨著刺激強(qiáng)度的增加而增加。在這些觀察之后，出現(xiàn)了一些與MLR功能相關(guān)的問題，即如何確定MLR的精確位置以及如何確定負(fù)責(zé)觀察到的效應(yīng)的神經(jīng)元類型。解剖學(xué)上，MLR的功能定義包括中腦區(qū)域，包括腳前額核（PPN）、楔狀前核和楔狀核的吻尾毗鄰區(qū)（pCnF和CnF）以及相鄰的中腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（mRT）。這些區(qū)域包含混合的谷氨酸和GABA能神經(jīng)元，PPN也包含膽堿能神經(jīng)元，需要一種策略來解剖和理解MLR功能的位置和神經(jīng)遞質(zhì)身份。

PPN的研究具有臨床意義。應(yīng)用PPN腦深部刺激（DBS）改善帕金森病步態(tài)和平衡癥狀產(chǎn)生了不同的發(fā)現(xiàn)。在一篇綜述文章強(qiáng)調(diào)，盡管多年來一直在進(jìn)行臨床研究，但PPN區(qū)域的功能多樣性可能是缺乏改善帕金森�。≒D）癥狀的應(yīng)用策略共識(shí)的關(guān)鍵原因（Garcia Rill et al.，2019）�？傊�，雖然CnF-vGlut2神經(jīng)元可以在逃逸環(huán)境中驅(qū)動(dòng)運(yùn)動(dòng)，但相鄰區(qū)域（包括PPN）功能的結(jié)果無法協(xié)調(diào)。這些不同的觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)，鑒于只有一小部分MLR神經(jīng)元編碼運(yùn)動(dòng)，有必要更好地描述該中腦區(qū)域的功能性神經(jīng)元多樣性，也涉及其他運(yùn)動(dòng)行為。此外，在運(yùn)動(dòng)中考慮速度調(diào)節(jié)和肢體協(xié)調(diào)之外的其他方面也很重要，要知道它的成功執(zhí)行還需要姿勢(shì)調(diào)整和其他運(yùn)動(dòng)程序的抑制。

在這里，作者基于目標(biāo)連接可能與功能相關(guān)的前提，確定并功能性解剖谷氨酸能MLR亞群。作者發(fā)現(xiàn)，空間鄰近的MLR-vGlut2神經(jīng)元根據(jù)軸突靶點(diǎn)、轉(zhuǎn)基因標(biāo)記物表達(dá)、神經(jīng)元活動(dòng)和行為中的作用分離不同的神經(jīng)元群。脊柱投射群體（MLR>SC）不同于以Rbp4Cre轉(zhuǎn)基因（MLR-Rbp4）特異標(biāo)記的基底節(jié)輸出結(jié)構(gòu)為靶點(diǎn)的上升群體。雖然MLR>SC神經(jīng)元在直立過程中受到正向調(diào)節(jié)，但MLR-Rbp4神經(jīng)元主要在前肢行為抓取和梳理過程中呈現(xiàn)興奮性。光遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)證明了MLR>SC神經(jīng)元在身體伸展中的作用，同時(shí)指出了MLR-Rbp4神經(jīng)元在調(diào)節(jié)各種行為中的作用。作者得出結(jié)論，功能不同的MLR亞群的接近可能解釋了谷氨酸能MLR神經(jīng)元的不同結(jié)果，并為設(shè)計(jì)新策略以改善涉及PPN區(qū)域的PD癥狀提供了重要信息。

結(jié)果

MLR-vGlut2神經(jīng)元單獨(dú)的下行和上行群體

作者首先通過下行和/或上行投射確定谷氨酸能MLR神經(jīng)元的精確位置。作者將具有Cre依賴性條件表達(dá)和逆行神經(jīng)元靶向潛能（rAAV）的腺相關(guān)病毒（AAVs）（Tervo等人，2016）注射到選擇的下行和上行MLR投射靶中。作者提供了表達(dá)不同標(biāo)記蛋白的RAAV，這些標(biāo)記蛋白靶向細(xì)胞核（nTag），以便檢測(cè)細(xì)胞體的位置。作者通過向vGlut2Cre小鼠注射rAAV-flex-nTag變體，將分析局限于谷氨酸能MLR神經(jīng)元（圖1A）。為了用下行投射靶向MLR-vGlut2神經(jīng)元，作者將rAAV-flex-nTag1和-Tag2分別注入延髓網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（Med）和SC（見STAR方法）。作為MLR-vGlut2神經(jīng)元的主要上升靶點(diǎn)，作者將rAAV-flex-nTag3注入嚙齒動(dòng)物的主要基底節(jié)輸出結(jié)構(gòu)——黑質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（SNr）（Oorschot，1996；Smith等人，1998年）（圖1A）。
Rbp4Cre轉(zhuǎn)基因標(biāo)記具有SN投射的谷氨酸能MLR神經(jīng)元

緊鄰膽堿能PPN神經(jīng)元的谷氨酸能SN投射神經(jīng)元群促使作者確定是否能找到遺傳途徑進(jìn)入這些神經(jīng)元。作者將AAV-PHP.eB-flex-nTag病毒（一種AAV變體，有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)）全身注射到表達(dá)Cre重組酶的現(xiàn)有小鼠系中（Chan等人，2017年）。作者發(fā)現(xiàn)，用于靶向大腦皮層第5層錐體束（PT）神經(jīng)元的轉(zhuǎn)基因小鼠系Rbp4Cre（Gerfen et al.，2013）也在緊鄰膽堿能PPN神經(jīng)元的神經(jīng)元群中表現(xiàn)出選擇性表達(dá)（圖2A）。MLR-Rbp4神經(jīng)元的定量顯示，mRT和PPN亞區(qū)的分布情況比pCnF和CnF更為明顯，吻尾側(cè)分布情況與谷氨酸能MLR>SN神經(jīng)元的分布情況一致（圖2A）。
谷氨酸能MLR亞群的差異作用調(diào)節(jié)

針對(duì)下行和上行興奮性MLR神經(jīng)元群的可能性，通過Inscopix自由行為顯微鈣成像系統(tǒng)來監(jiān)測(cè)它們的活動(dòng)，在曠場(chǎng)測(cè)試中記錄動(dòng)物自由活動(dòng)行為期間的神經(jīng)發(fā)放情況（圖3A）。之前的研究表明，部分MLR-vGlut2神經(jīng)元的活動(dòng)可以跟蹤運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，作者首先評(píng)估了是否檢測(cè)到在運(yùn)動(dòng)發(fā)作期間優(yōu)先活躍的神經(jīng)元。為了確定行為期間的神經(jīng)元活動(dòng)變化，作者計(jì)算了研究行為期間的平均熒光，并減去未檢測(cè)到行為的幀期間的平均熒光，從而得出與靜止事件相比分配給每個(gè)神經(jīng)元的行為調(diào)制指數(shù)。作者發(fā)現(xiàn)，在運(yùn)動(dòng)過程中，只有一小部分神經(jīng)元在運(yùn)動(dòng)過程中受到正調(diào)制，這一特性與MLR>SC比MLR-Rbp4神經(jīng)元更相關(guān)（MLR>SC:39.3%；MLR-Rbp4:19.9%）。

這些發(fā)現(xiàn)提出了MLR>SC和MLR-Rbp4神經(jīng)元是否在其他行為中出現(xiàn)興奮性的問題。因此，作者跟蹤了其他頻繁自發(fā)行為的發(fā)生——在曠場(chǎng)中直立、梳理和抓取食物（圖3B）。通過使用高速視頻和加速度傳感器數(shù)據(jù)的監(jiān)督學(xué)習(xí)算法識(shí)別行為事件（圖3C）。通過分析MLR>SC神經(jīng)元的反應(yīng)（圖3D-3H），作者發(fā)現(xiàn)與直立開始相關(guān)的熒光信號(hào)增加（圖3E）。相比之下，運(yùn)動(dòng)的開始或前肢行為的抓取和梳理并未導(dǎo)致總體MLR>SC群體的發(fā)放增加（圖3E）。

接下來，作者確定了單個(gè)MLR>SC神經(jīng)元的調(diào)制指數(shù)及其在四種分析行為中的分布。作者發(fā)現(xiàn)，在直立過程中，MLR>SC神經(jīng)元的發(fā)放明顯，而在其他三種行為中，只有少數(shù)神經(jīng)元受到強(qiáng)烈的正向調(diào)節(jié)（圖3F和3G）。因此，同樣在單神經(jīng)元水平上，直立過程中的積極調(diào)節(jié)的影響，而在其他行為中的調(diào)節(jié)影響可以在一些神經(jīng)元中檢測(cè)到，但要小得多（圖3E-3G）。作者還通過單神經(jīng)元和單次試驗(yàn)分析（圖3D）研究了神經(jīng)元活動(dòng)與直立期之間的關(guān)系。單個(gè)MLR>SC神經(jīng)元在時(shí)間和大小上表現(xiàn)出不同的動(dòng)力學(xué)，這在分析在同一行為時(shí)間幀上在一只小鼠中成像的多個(gè)MLR>SC神經(jīng)元時(shí)可以特別清楚地看出（圖3D）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明MLR>SC神經(jīng)元更傾向于直立。
MLR神經(jīng)元群體的行為差異解碼

為了進(jìn)一步探索神經(jīng)元活動(dòng)特征與不同行為之間的關(guān)系，作者采用了相反的方法。作者提取了所有分析神經(jīng)元的神經(jīng)元活動(dòng)的峰值，并計(jì)算了在峰值時(shí)間（圖4A）或特定時(shí)間內(nèi)發(fā)生的每種行為的概率-單個(gè)神經(jīng)元的時(shí)間窗口為2.5s至+5s（圖4B）。作者發(fā)現(xiàn)，MLR>SC神經(jīng)元在動(dòng)物直立期間強(qiáng)烈反應(yīng)的概率高，其次是行走，但在抓取和梳理期間很少發(fā)現(xiàn)峰值（圖4A和4B）。相比之下，MLR-Rbp4神經(jīng)元的活動(dòng)峰值與抓取相關(guān)，其次是梳理，而行走和直立表現(xiàn)得很弱（圖4A和4B）。總之，這些發(fā)現(xiàn)支持了以下觀察：大多數(shù)MLR>SC神經(jīng)元在全身行為期間反應(yīng)，而MLR-Rbp4神經(jīng)元在前肢的抓取和梳理行為期間表現(xiàn)出的反應(yīng)。
MLR>SC神經(jīng)元調(diào)節(jié)身體伸展

接下來，作者通過功能互補(bǔ)性缺失和增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)研究了MLR>SC和MLR-Rbp4神經(jīng)元在行為中的作用�？紤]到MLR>SC和MLR-Rbp4群體均表現(xiàn)出與多種行為相關(guān)的復(fù)雜調(diào)節(jié)特性的觀察結(jié)果，預(yù)測(cè)每個(gè)整體群體的光遺傳學(xué)擾動(dòng)，以測(cè)試神經(jīng)元活動(dòng)的聯(lián)合下調(diào)或上調(diào)對(duì)行為輸出的影響。
MLR-Rbp4神經(jīng)元通過影響基底神經(jīng)節(jié)來調(diào)節(jié)行為

為了確定MLR-Rbp4神經(jīng)元在行為中的作用，作者通過在Rbp4神經(jīng)元中表達(dá)stGtACR2來進(jìn)行功能缺失實(shí)驗(yàn)（圖6A）。作者推斷，急性降低MLR-Rbp4神經(jīng)元的神經(jīng)元活動(dòng)可能導(dǎo)致行為的普遍去抑制，因?yàn)閷?duì)促進(jìn)基底節(jié)輸出結(jié)構(gòu)的行為抑制的興奮性驅(qū)動(dòng)減少（圖2和S2）。MLR-Rbp4神經(jīng)元的雙側(cè)光遺傳抑制確實(shí)導(dǎo)致身體運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)（圖6B；視頻S2）。光遺傳學(xué)誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)包括整個(gè)試驗(yàn)中具有高度可變運(yùn)動(dòng)序列的所有身體部位（圖6B、S7A和S7B；視頻S2），與刺激時(shí)小鼠的特定運(yùn)動(dòng)無關(guān)（數(shù)據(jù)未顯示）。作者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)光刺激仍在進(jìn)行時(shí)，異常光誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)停止，并且在激光偏移時(shí)或之后未觀察到額外的過度運(yùn)動(dòng)（圖6C、S7A和S7B；視頻S2）。對(duì)照組小鼠的光照不會(huì)引起跟蹤身體部位的速度變化（圖S7A）�？傊�，這些研究結(jié)果表明，MLR-Rbp4神經(jīng)元的光遺傳學(xué)抑制導(dǎo)致全身各部位運(yùn)動(dòng)輸出的快速失調(diào)，這可能是由于MLR-Rbp4神經(jīng)元和基底節(jié)輸出結(jié)構(gòu)之間的生理調(diào)信號(hào)受到干擾。
討論

運(yùn)動(dòng)是一種普遍的動(dòng)物行為，涉及分布式神經(jīng)元環(huán)路。MLR的累積研究已經(jīng)引發(fā)了關(guān)于理解其在自然運(yùn)動(dòng)行為中的功能討論，但DBS在難治性PD癥狀方面的應(yīng)用還不清楚。在這里，作者展示了專門的神經(jīng)元群在不同形式的身體運(yùn)動(dòng)中有反應(yīng)。作者相信，這些發(fā)現(xiàn)為正在進(jìn)行的爭(zhēng)論提供了線索，并呼吁從根本上更新對(duì)中腦區(qū)域的神經(jīng)元功能的觀點(diǎn)。作者將利用inscopix系統(tǒng)繼續(xù)研究中腦神經(jīng)元對(duì)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)功能和DBS干預(yù)設(shè)計(jì)的影響

參考文獻(xiàn):

Ferreira-Pinto MJ, Kanodia H, Falasconi A, Sigrist M, Esposito MS, Arber S. Functional diversity for body actions in the mesencephalic locomotor region. Cell. 2021

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