GSK：使用單一DNA結(jié)構(gòu)快速構(gòu)建穩(wěn)定的慢病毒載體生產(chǎn)細(xì)胞系

慢病毒載體(Lentiviral vectors, LVs)是以人類(lèi)免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體，最被廣泛應(yīng)用的慢病毒載體是基于雙鏈RNA病毒人類(lèi)免疫缺陷I型病毒（HIV-1）^[1]。HIV-1型慢病毒載體系統(tǒng)的建立，經(jīng)歷了一個(gè)逐步完善的過(guò)程，其生物安全性不斷提高。

LVs對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，更加安全，并可以在體內(nèi)長(zhǎng)期的表達(dá)。這一特性使LVs成為臨床研究的理想選擇，美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)和歐洲藥物管理局(EMA)已經(jīng)批準(zhǔn)多個(gè)以慢病毒為基礎(chǔ)的基因療法。目前，LVs在β-地中海貧血（β-thalassemia）、鐮狀細(xì)胞性貧血（Sickle cell anemia）、實(shí)體瘤（Solid tumors）和COVID-19等疾�。▓D1）的細(xì)胞和基因治療中得到了廣泛的應(yīng)用，如CAR-T細(xì)胞治療。

英國(guó)著名的葛蘭素史克藥物研究中心報(bào)告了一種通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染編碼所有慢病毒載體成分的單個(gè) DNA 結(jié)構(gòu)體到 293T 細(xì)胞，快速生成穩(wěn)定生產(chǎn)慢病毒載體的細(xì)胞系的方法。由此產(chǎn)生的穩(wěn)定懸浮細(xì)胞系可生產(chǎn)出與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染一樣高滴度的慢病毒，可以在一次性攪拌式生物反應(yīng)器中輕松放大，并且在后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中遺傳和功能穩(wěn)定。通過(guò)在慢病毒載體的上游加工過(guò)程中消除對(duì)有效瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的要求，并改用固有的可擴(kuò)展懸浮細(xì)胞培養(yǎng)形式，他們認(rèn)為這種方法將生產(chǎn)出比當(dāng)前制造工藝更高的批量產(chǎn)量，并使患者能夠更好地獲得基于慢病毒載體的藥物^[3]。

載體構(gòu)建
 

LVs生產(chǎn)細(xì)胞株通常是基于順序穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或?qū)⒕幋a每個(gè)載體組分(轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒gagpol-rev和包膜質(zhì)粒VSVg)的DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)到基因組不同位點(diǎn)的宿主細(xì)胞。這種策略導(dǎo)致細(xì)胞系開(kāi)發(fā)時(shí)間長(zhǎng)，并且至少有一個(gè)基因座可能發(fā)生遺傳或轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定的高風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致生產(chǎn)力損失。為了避免這種情況，GSK使用第三代慢病毒載體系統(tǒng)，載體組件由四個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄單元編碼，每個(gè)單元都有自己的啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號(hào)，防止產(chǎn)生復(fù)制能力強(qiáng)的慢病毒(RCL)顆粒，一個(gè)將所有的載體成分構(gòu)建成單個(gè)大DNA結(jié)構(gòu)（BAC）并整合入宿主細(xì)胞（圖2）。

慢病毒載體穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系的開(kāi)發(fā)

慢病毒載體的穩(wěn)定生產(chǎn)
 

利用微滴式數(shù)字PCR (ddPCR)定量每個(gè)載體成分DNA拷貝數(shù)，每個(gè)成分的拷貝數(shù)在1到10拷貝數(shù)/細(xì)胞之間變化（圖4A）。通過(guò)靶向位點(diǎn)擴(kuò)增技術(shù)（Targeted locus amplification，TLA）對(duì)293Tsa EGFP clone 2的BAC DNA進(jìn)行整合位點(diǎn)定位，在chr3:169,967,149-169,967,179處發(fā)現(xiàn)了一個(gè)整合位點(diǎn)（圖4B），在293Tsa GLOBE clone 19中，于chrl: 146,557,007和chrX: 127,363,436處發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)整合位點(diǎn)（圖4C），表明BAC DNA在隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組之前發(fā)生了異位串聯(lián)，轉(zhuǎn)染圓形的BAC DNA質(zhì)粒，宿主的DNA修復(fù)蛋白會(huì)對(duì)其進(jìn)行重排，從而產(chǎn)生線性整合DNA。
 

以MOI=50或100的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34⁺細(xì)胞，通過(guò)qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的載體拷貝數(shù)(VCN)，重復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)使得每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生2個(gè)拷貝的VCN，表明穩(wěn)定的細(xì)胞系產(chǎn)生的病毒載體可以感染類(lèi)似難以感染的原代細(xì)胞(圖4D)。

構(gòu)建相同的4質(zhì)粒系統(tǒng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293Tsa細(xì)胞，通過(guò)RNA測(cè)序(RNA-seq)來(lái)定量各載體組分的RNA水平。各組分的RNA瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)之間沒(méi)有顯著差異，只有293Tsa GLOBE clone 19的rev表達(dá)升高(rev比瞬時(shí)表達(dá)高2.88倍，p = 0.0003)；并且，穩(wěn)定克隆的不同培養(yǎng)瓶之間每個(gè)載體組分的RNA表達(dá)水平的變異性顯著低于瞬時(shí)表達(dá)(p < 0.001) (圖5A)。另外，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)的慢病毒在病毒滴度效價(jià)方面均未觀察到顯著差異(圖5B)。

使用低溫儲(chǔ)存的12個(gè)單克隆細(xì)胞進(jìn)行排序，在15ml一次性攪拌槽微生物反應(yīng)器中制備慢病毒載體并檢測(cè)其病毒滴度（圖6A）。選取效價(jià)最高的4個(gè)克隆（clone1, 3, 9, 10）連續(xù)搖瓶培養(yǎng)數(shù)周來(lái)評(píng)估病毒滴度和遺傳穩(wěn)定性，使用選取三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)下，使用ddPCR和ELISA法對(duì)比病毒滴度，clone3, 9, 10的病毒滴度沒(méi)有顯著變化，clone1的滴度下降(p = 0.0011)（圖6B）；在相同的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采集非誘導(dǎo)的細(xì)胞基因組DNA檢測(cè)BAC各基因拷貝數(shù)量變化，四個(gè)克隆在遺傳上都是穩(wěn)定的，既沒(méi)有丟失整合DNA編碼的載體成分，也沒(méi)有通過(guò)重復(fù)感染擴(kuò)增轉(zhuǎn)移載體拷貝數(shù)（VCN）（圖6B）。

具有復(fù)制能力的慢病毒（RCL）的檢測(cè)
 

為了測(cè)定這些克隆細(xì)胞是否會(huì)產(chǎn)生RCL，采用產(chǎn)物增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄酶(PERT)檢測(cè)了12個(gè)樣品，這12個(gè)樣品分別來(lái)自293Tsa EGFP clone 2、GLOBE clone 19和GLOBE.T87Q clone 1、3、9和10這6個(gè)克隆細(xì)胞的的收集樣品和濃縮后樣品。結(jié)果顯示，這些穩(wěn)定生產(chǎn)的細(xì)胞系中都沒(méi)有檢測(cè)到RCL（表1）。

總結(jié)

在GSK分享的單DNA分子BAC結(jié)構(gòu)中將CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄單元以transfer-gagpol-VSVg-rev的順序首尾1:1:1:1相連排列，但是也發(fā)現(xiàn)，在相同的BAC轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，不同的單克隆細(xì)胞的每個(gè)載體基因DNA拷貝數(shù)和mRNA表達(dá)水平存在差異。因此，在細(xì)胞系構(gòu)建的過(guò)程中，應(yīng)篩選足夠數(shù)量的克隆，以獲得一個(gè)mRNA表達(dá)水平理想的克隆，獲得最佳的產(chǎn)量和感染性。將BAC結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)?zāi)軌驈膸资畟�(gè)單克隆細(xì)胞系中篩選出高產(chǎn)的克隆，因此GSK認(rèn)為，這種包裝細(xì)胞系的方法能夠減少克隆之間變異。未來(lái)也可以進(jìn)一步的載體改造，將其中的基因片段用改進(jìn)的基因進(jìn)行替換，快速利用多個(gè)片段組裝或基因合成為一個(gè)BAC片段，單次的轉(zhuǎn)染能簡(jiǎn)化并加速慢病毒穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建流程，提高慢病毒載體的產(chǎn)量、質(zhì)量和安全性。FDA和EMA也認(rèn)為這種穩(wěn)定生產(chǎn)慢病毒的細(xì)胞系平臺(tái)可用于生產(chǎn)臨床使用的慢病毒，也沒(méi)有提出慢病毒載體制造工藝之外的要求。這種簡(jiǎn)單有效的生產(chǎn)細(xì)胞株培養(yǎng)技術(shù)，可廣泛應(yīng)用于慢病毒載體制造的產(chǎn)業(yè)化，并有可能在未來(lái)為更多的患者提供基因治療藥物。
 

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染為基礎(chǔ)的慢病毒載體制造工藝用于臨床是基因治療領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，但通常需要大量GMP級(jí)別的質(zhì)粒DNA和轉(zhuǎn)染試劑。相比較之下，構(gòu)建穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞株更適合于大規(guī)模的慢病毒的生產(chǎn)，建高產(chǎn)細(xì)胞株的主要流程如圖6所示，經(jīng)過(guò)單克隆細(xì)胞篩選、擴(kuò)增培養(yǎng)和驗(yàn)證，最終獲得細(xì)胞活力高、生長(zhǎng)能力強(qiáng)，并且表達(dá)水平、穩(wěn)定性、質(zhì)量情況都具有最高表現(xiàn)的單克隆細(xì)胞株。

GSK利用Cytena單細(xì)胞打印機(jī)替代常規(guī)的有限稀釋的方法篩選單克隆細(xì)胞，由于其溫和而高效的分選原理，使得單細(xì)胞率＞95%，克隆恢復(fù)率與有限稀釋相當(dāng)，獲得大量單克隆來(lái)源的細(xì)胞，并提供分選過(guò)程中的噴嘴圖片作為單克隆細(xì)胞來(lái)源的佐證，進(jìn)一步加速慢病毒生產(chǎn)細(xì)胞株構(gòu)建的工作流程，促進(jìn)基因與細(xì)胞治療的發(fā)展。

[1].Meng F, Chen C, Wan H, Zhou Q. [Advances of lentiviral vectors]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2014 Dec;17(12):870-6. Chinese. doi: 10.3779/j.issn.1009-3419.2014.12.09. PMID: 25539614; PMCID: PMC6000409.

[2].Ferreira MV, Cabral ET, Coroadinha AS. Progress and Perspectives in the Development of Lentiviral Vector Producer Cells. Biotechnol J. 2021 Jan;16(1):e2000017. doi: 10.1002/biot.202000017. Epub 2020 Aug 2. PMID: 32686901.

[3].Chen YH, Pallant C, Sampson CJ, Boiti A, Johnson S, Brazauskas P, Hardwicke P, Marongiu M, Marinova VM, Carmo M, Sweeney NP, Richard A, Shillings A, Archibald P, Puschmann E, Mouzon B, Grose D, Mendez-Tavio M, Chen MX, Warr SRC, Senussi T, Carter PS, Baker S, Jung C, Brugman MH, Howe SJ, Vink CA. Rapid Lentiviral Vector Producer Cell Line Generation Using a Single DNA Construct. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020 Aug 14;19:47-57. doi: 10.1016/j.omtm.2020.08.011. PMID: 32995359; PMCID: PMC7501408.