文獻解讀：新冠病毒核酸rRT-PCR分析注意事項
題目：rRT-PCR for SARS-CoV-2: Analytical considerations
期刊：Clinica Chimica Acta 516（2021）1-7
通訊作者：Mohammad Abdi
DOI號：10.1016/j.cca.2021.01.011
編譯：俞萍
一、背景介紹
新冠疫情仍然是全世界衛(wèi)生系統(tǒng)面臨的一個重大問題。早期準確檢測新冠病毒感染對于最大限度地減少傳播和治療至關重要。在檢測方法中，實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(rRT-PCR)被認為是金標準。
該檢測方法具有較高的特異性和靈敏性，但對于有癥狀的或CT掃描呈陽性的患者中出現(xiàn)假陰性結果來說仍然是一個挑戰(zhàn)。誤差來源可能是分析前(采樣、儲存和處理)、分析中(RNA提取、cDNA合成和擴增)和分析后(解釋和分析)。文章總結了這些潛在的誤差來源和減少誤差的措施。
二、分析前誤差
分析前最重要的誤差來源之一發(fā)生在取樣步驟中。其中最關鍵的是正確的采樣位置，包括鼻子、喉嚨和氣管導管等，要使用標準采樣耗材（尼龍植絨而非棉簽）進行采樣，拭子應在適當位置保持10秒并旋轉(zhuǎn)三次。采樣過程中，如果拭子被手套粉末、喉嚨末端的食物碎屑等污染物浸透，會對結果的準確性產(chǎn)生不利影響。
取樣后將這些誤差降至最低的方法是將拭子快速轉(zhuǎn)移到合適的運輸介質(zhì)中，并快速送到實驗室，同時控制運輸溫度（2–8℃）和時間（72小時內(nèi)）。
不正確的取樣和儲存可能是產(chǎn)生錯誤結果的重要來源，特別是在病毒載量低的樣本中。多項研究表明，在疾病的早期階段，病毒大多位于鼻部，因此在此期間從喉嚨中采樣更可能是假陰性，建議在癥狀出現(xiàn)后5或6天采集鼻咽和口咽拭子。
三、分析中誤差
分析中重要誤差可能發(fā)生在核酸提取步驟中，對所提取RNA的數(shù)量和質(zhì)量有很大影響。核酸提取過程中的主要污染蛋白是核酸結合蛋白，它可以干擾cDNA合成反應，特別是PCR過程。選擇合適的RNA提取方法是獲得有效結果的關鍵步驟，自動化磁珠法核酸提取被認為是最安全和最快的方法，這種方法只需要很少的人工干預。
內(nèi)源性和外源性核糖核酸酶降解RNA也可能影響提取RNA的質(zhì)量和數(shù)量，并導致假陰性結果。最終洗脫的核糖核酸應溶于不含RNA酶的水中，以防止RNA降解導致假陰性結果。核酸提取過程中有幾種試劑會降低PCR效率，如手套粉末、鹽、去污劑以及苯酚和乙醇等有機分子，因此在RNA提取過程中應避免使用或盡量減少使用。此外，避免提取的核酸暴露于紫外線照射也很重要。同時為了避免分子實驗室環(huán)境受到氣溶膠的影響，需要分區(qū)域?qū)嶒灐?br />
cDNA合成和擴增中引物和探針的儲存也是重要因素，反復凍融和長時間的光暴露降低了穩(wěn)定性和反應效率。準確移取RNA和酶在cDNA合成過程中起主要作用，移液方法和移液器應該都是校驗過的。在一步法的RNA逆轉(zhuǎn)錄和cDNA擴增中，對于RNA水平較低的樣本，擴增效率低導致錯誤分析時有發(fā)生。高濃度的逆轉(zhuǎn)錄酶對擴增有抑制作用。
PCR儀校準發(fā)生故障也有可能導致不準確的擴增溫度和循環(huán)時間。新冠病毒rRT-PCR檢測中最重要的挑戰(zhàn)之一是選擇效率最高的引物，已證實ORF1ab、N和RdRp引物比其他引物具有更高的敏感性、特異性和陽性預測價值。病毒基因組發(fā)生突變和重組，使得新冠肺炎檢測相當困難。為了提高方法的靈敏度并克服這一問題，應更多地考慮引物濃度、引物退火和設計用于多靶點檢測的引物，在篩選擴增程序中應考慮使用不同引物的組合策略來提高檢測能力。
通過常用rRT-PCR方法產(chǎn)生假陰性結果的最重要原因之一是病毒載量低導致，研究表明數(shù)字PCR在檢測低病毒載量樣本方面比rRT- qPCR具有更高的靈敏度和特異性。
四、分析后誤差
新冠肺炎檢測相關的分析后誤差并不是很多。最常見的誤差來源之一是操作員對數(shù)據(jù)的錯誤解讀。通過基線、閾值和擴增曲線繪制精確的圖表，并確保檢測靈敏度，可以大大降低這些錯誤解讀的可能性。頻繁凍融標準溶液也會增加CT值，所以標準溶液應避免反復凍融影響結果判讀。
擴增曲線對于確定基線和閾值循環(huán)很重要，新冠肺炎陽性的rRT-PCR結果的CT值應小于40，大于40的結果應視為陰性結果。CT值為37–40的樣本必須重新取樣檢測。
對內(nèi)標無擴增首先分析PCR過程是否有問題。如果PCR重復結果還是如此，則需要重新取樣檢測。實時PCR是一種非常靈敏的方法，因此移液、組分質(zhì)量、設備校準和溫度等都可能會導致結果不穩(wěn)定和不準確。因此，使用內(nèi)標可以提高PCR過程的準確性。
實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應的效率是一個關鍵因素。最佳效率為90 ~ 110%，最佳擴增效率是獲得準確PCR結果的必要條件，在進行數(shù)據(jù)分析之前應予以考慮。
期刊：Clinica Chimica Acta 516（2021）1-7
通訊作者：Mohammad Abdi
DOI號：10.1016/j.cca.2021.01.011
編譯：俞萍
一、背景介紹
新冠疫情仍然是全世界衛(wèi)生系統(tǒng)面臨的一個重大問題。早期準確檢測新冠病毒感染對于最大限度地減少傳播和治療至關重要。在檢測方法中，實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(rRT-PCR)被認為是金標準。
該檢測方法具有較高的特異性和靈敏性，但對于有癥狀的或CT掃描呈陽性的患者中出現(xiàn)假陰性結果來說仍然是一個挑戰(zhàn)。誤差來源可能是分析前(采樣、儲存和處理)、分析中(RNA提取、cDNA合成和擴增)和分析后(解釋和分析)。文章總結了這些潛在的誤差來源和減少誤差的措施。
二、分析前誤差
分析前最重要的誤差來源之一發(fā)生在取樣步驟中。其中最關鍵的是正確的采樣位置，包括鼻子、喉嚨和氣管導管等，要使用標準采樣耗材（尼龍植絨而非棉簽）進行采樣，拭子應在適當位置保持10秒并旋轉(zhuǎn)三次。采樣過程中，如果拭子被手套粉末、喉嚨末端的食物碎屑等污染物浸透，會對結果的準確性產(chǎn)生不利影響。
取樣后將這些誤差降至最低的方法是將拭子快速轉(zhuǎn)移到合適的運輸介質(zhì)中，并快速送到實驗室，同時控制運輸溫度（2–8℃）和時間（72小時內(nèi)）。
三、分析中誤差
分析中重要誤差可能發(fā)生在核酸提取步驟中，對所提取RNA的數(shù)量和質(zhì)量有很大影響。核酸提取過程中的主要污染蛋白是核酸結合蛋白，它可以干擾cDNA合成反應，特別是PCR過程。選擇合適的RNA提取方法是獲得有效結果的關鍵步驟，自動化磁珠法核酸提取被認為是最安全和最快的方法，這種方法只需要很少的人工干預。
內(nèi)源性和外源性核糖核酸酶降解RNA也可能影響提取RNA的質(zhì)量和數(shù)量，并導致假陰性結果。最終洗脫的核糖核酸應溶于不含RNA酶的水中，以防止RNA降解導致假陰性結果。核酸提取過程中有幾種試劑會降低PCR效率，如手套粉末、鹽、去污劑以及苯酚和乙醇等有機分子，因此在RNA提取過程中應避免使用或盡量減少使用。此外，避免提取的核酸暴露于紫外線照射也很重要。同時為了避免分子實驗室環(huán)境受到氣溶膠的影響，需要分區(qū)域?qū)嶒灐?br />
cDNA合成和擴增中引物和探針的儲存也是重要因素，反復凍融和長時間的光暴露降低了穩(wěn)定性和反應效率。準確移取RNA和酶在cDNA合成過程中起主要作用，移液方法和移液器應該都是校驗過的。在一步法的RNA逆轉(zhuǎn)錄和cDNA擴增中，對于RNA水平較低的樣本，擴增效率低導致錯誤分析時有發(fā)生。高濃度的逆轉(zhuǎn)錄酶對擴增有抑制作用。
PCR儀校準發(fā)生故障也有可能導致不準確的擴增溫度和循環(huán)時間。新冠病毒rRT-PCR檢測中最重要的挑戰(zhàn)之一是選擇效率最高的引物，已證實ORF1ab、N和RdRp引物比其他引物具有更高的敏感性、特異性和陽性預測價值。病毒基因組發(fā)生突變和重組，使得新冠肺炎檢測相當困難。為了提高方法的靈敏度并克服這一問題，應更多地考慮引物濃度、引物退火和設計用于多靶點檢測的引物，在篩選擴增程序中應考慮使用不同引物的組合策略來提高檢測能力。
通過常用rRT-PCR方法產(chǎn)生假陰性結果的最重要原因之一是病毒載量低導致，研究表明數(shù)字PCR在檢測低病毒載量樣本方面比rRT- qPCR具有更高的靈敏度和特異性。
四、分析后誤差
新冠肺炎檢測相關的分析后誤差并不是很多。最常見的誤差來源之一是操作員對數(shù)據(jù)的錯誤解讀。通過基線、閾值和擴增曲線繪制精確的圖表，并確保檢測靈敏度，可以大大降低這些錯誤解讀的可能性。頻繁凍融標準溶液也會增加CT值，所以標準溶液應避免反復凍融影響結果判讀。
擴增曲線對于確定基線和閾值循環(huán)很重要，新冠肺炎陽性的rRT-PCR結果的CT值應小于40，大于40的結果應視為陰性結果。CT值為37–40的樣本必須重新取樣檢測。
對內(nèi)標無擴增首先分析PCR過程是否有問題。如果PCR重復結果還是如此，則需要重新取樣檢測。實時PCR是一種非常靈敏的方法，因此移液、組分質(zhì)量、設備校準和溫度等都可能會導致結果不穩(wěn)定和不準確。因此，使用內(nèi)標可以提高PCR過程的準確性。
實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應的效率是一個關鍵因素。最佳效率為90 ~ 110%，最佳擴增效率是獲得準確PCR結果的必要條件，在進行數(shù)據(jù)分析之前應予以考慮。
五、結論
文章總結分析了假陰性或假陽性結果的一些可能來源。分析前誤差被認為是新冠肺炎診斷中的主要可能誤差來源，包括采樣耗材、采樣位置和采樣時間。在分析階段，RNA提取是主要關注點，其數(shù)量和質(zhì)量是重要因素。同時通過引物設計、儲存條件、PCR組分和移液器校準來優(yōu)化rRT-PCR過程，如果病毒基因組發(fā)生突變，則應優(yōu)化新的引物。
在分析后階段，必須使用各種陽性和陰性對照品來確認和解釋結果。因此，使用質(zhì)控品對每次檢測都至關重要，同時分析解釋數(shù)據(jù)的人員應該具有專業(yè)知識和能力。
文章總結分析了假陰性或假陽性結果的一些可能來源。分析前誤差被認為是新冠肺炎診斷中的主要可能誤差來源，包括采樣耗材、采樣位置和采樣時間。在分析階段，RNA提取是主要關注點，其數(shù)量和質(zhì)量是重要因素。同時通過引物設計、儲存條件、PCR組分和移液器校準來優(yōu)化rRT-PCR過程，如果病毒基因組發(fā)生突變，則應優(yōu)化新的引物。
在分析后階段，必須使用各種陽性和陰性對照品來確認和解釋結果。因此，使用質(zhì)控品對每次檢測都至關重要，同時分析解釋數(shù)據(jù)的人員應該具有專業(yè)知識和能力。
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