比率成像顯微鏡Inscoper liveRATIO在監(jiān)測T細胞活化的應(yīng)用

當受到環(huán)境刺激時，許多細胞類型使用鈣信號進行細胞內(nèi)信息處理并通過激活特定基因表達程序來誘導(dǎo)適當?shù)纳�物反�?yīng)。例如，鈣瞬變負責免疫細胞的激活。在本應(yīng)用說明中，我們將對 γδ T 細胞中的鈣瞬變進行成像，以表征它們在磷酸化抗原呈遞后的活化。所有這些實驗都是使用 Inscoper liveRATIO 實現(xiàn)的，這是一種為比率成像量身定制的解決方案。

T淋巴細胞中的鈣信號
從細胞外到細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)由第二信使介導(dǎo)。這些細胞信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵參與者可能是核苷酸、脂質(zhì)、自由基或離子。它們都與特定目標結(jié)合以誘導(dǎo)具有特異性的下游信號。例如，離子具有在信號誘導(dǎo)后誘導(dǎo)快速響應(yīng)的特性。鈣是一種普遍存在的次級信使，可調(diào)節(jié)多種途徑，如細胞存活、增殖、激活、神經(jīng)發(fā)生、細胞運動、肌肉收縮或神經(jīng)元突觸傳遞（Paemeleire 等人，2000 年； 貝里奇等人，2000，2003; 克拉彭，2007；格林伯格和康納思，2012； 休莫等人，2018；Zumerle 等人，2019 年）。
 
鈣在 T 細胞的活化中起主要作用。這些淋巴細胞是一類在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的白細胞，具有在其表面呈遞 T 細胞受體 (TCR) 以檢測抗原存在的特殊性。在基礎(chǔ)條件下，靜息淋巴細胞維持細胞內(nèi)低濃度的鈣（維格和基內(nèi)特，2009 年）。然而，TCR 對抗原的識別會誘導(dǎo)其活化，其特征是細胞內(nèi)鈣水平的快速增加。
 
激活的 T 細胞然后能夠根據(jù)其類型參與免疫反應(yīng)：細胞毒性 T (CD8+) 細胞破壞受感染的細胞/病原體，輔助 T (CD4+) 細胞激活其他免疫因子，調(diào)節(jié)性 T 細胞 (Treg) 阻止激活在自身免疫淋巴細胞中，自然殺傷 T 細胞 (NKT) 分泌細胞因子并裂解抗原靶點。
其他一些 T 細胞被認為是“非常規(guī)的”，如 MAIT 或 γδ T 細胞。所有這些細胞類型的協(xié)調(diào)對于免疫反應(yīng)的成功是必要的。
 
淋巴細胞是免疫防御機制的核心組成部分。它們的激活是免疫反應(yīng)所需的關(guān)鍵步驟之一�？梢允褂帽嚷食上癖O(jiān)測鈣瞬變來探索這種復(fù)雜的生理現(xiàn)象（巴拉戈帕蘭等人， 2011). 這項技術(shù)可以為研究人員提供一種提高對免疫細胞激活的理解和探索病理生理障礙的方法

INSCOPER LIVERATIO，比例成像的現(xiàn)代多功能解決方案
Inscoper liveRATIO 是用于比率成像的完整顯微鏡解決方案。該產(chǎn)品由與生命科學中使用的高級視頻顯微鏡兼容的軟件和硬件包組成（圖 1）
  圖 2：配備 Inscoper liveRATIO 的鈣比率成像實驗裝置

鈣瞬變的比例成像​
目標：
在這里，我們想要表征磷酸抗原呈遞后 γδ T 細胞的激活。為此，我們將監(jiān)測淋巴細胞中的鈣瞬變。
 
材料：
該實驗是與顯微鏡設(shè)備 MicroPICell（法國南特）合作實現(xiàn)的。使用配備 HC Plan Apo 20x 0.70 NA（506166；Leica）的 Leica DMI 6000B 顯微鏡（Leica，Wetzlar，Germany）（圖 2）。對于這個實驗，相機是數(shù)字 CMOS Orca Flash 4.0（C11440；Hamamatsu Photonics，Hamamatsu，日本），光引擎來自 CoolLED（pE-800富拉；CoolLED，Andover，UK）。使用 Inscoper liveRATIO (INSCOPER, Cesson-Sévigné, France) 進行顯微鏡控制、采集和實時圖像處理。
 
方法：
γδ T 細胞用 Fura-2 AM（F1201；Thermofisher，Waktham，MA，USA）標記，這是一種對游離細胞內(nèi)鈣具有高親和力的熒光探針。其在低鈣濃度（最大激發(fā) = 362 nm，最大發(fā)射 = 512 nm）下的光譜特性與高鈣條件（最大激發(fā) = 335 nm，最大發(fā)射 = 505 nm）下的光譜特性不同。 340nm 和 380nm 的激發(fā)可以分別用鈣結(jié)合和游離熒光探針成像。在采集過程中，將磷酸化抗原手動添加到淋巴細胞培養(yǎng)基中，并監(jiān)測熒光。使用 DMSO（用于 Fura-2 稀釋）作為陰性對照也進行了相同的實驗。
結(jié)果：
許多染料根據(jù)其特性（結(jié)合鈣或在質(zhì)膜上被動擴散的能力、激發(fā)/發(fā)射波長、強度、亮度和穩(wěn)定性）用于進行鈣成像。此外，可以使用非比率（更方便和更快，但不適合量化）或比率方法（更復(fù)雜但完全適合定量測量）進行成像。