LN-18人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法！

 　　一、細(xì)胞簡(jiǎn)介：

　　細(xì)胞名稱：LN-18人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞

　　平臺(tái)編號(hào):zl-057034

　　細(xì)胞特性

　　1）來源：神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞

　　2）形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

　　3）含量：>1x106個(gè)/mL

　　4）污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測(cè)為陰性

　　5）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

　　6）細(xì)胞用途：僅供科研使用。

　　二、細(xì)胞培養(yǎng)步驟

　　1．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

　　1）準(zhǔn)備DMEM-H培養(yǎng)基添加NaHCO31.5g/L)，90%；胎牛血清，10%。（DMEM液體培養(yǎng)基：GIBCO，11995-065）。

　　2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

　　3）凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。

　　三．細(xì)胞處理：

　　1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

　　2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

　　對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

　　1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

　　2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

　　3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

　　4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

　　對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

　　3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。

　　四、運(yùn)輸和保存

　�。�1）使用含有優(yōu)質(zhì)胎牛血清的2ml凍存管發(fā)送存活細(xì)胞。

　�。�2）收到細(xì)胞后，可在1000RPM，常溫條件下，離心5min后，于潔凈操作臺(tái)棄去上清，加入推薦使用的培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)移至10cm培養(yǎng)皿或者T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，傳代達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行凍存。具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。