利用 EGFR 靶向 NIR-II 探針進(jìn)行食管鱗癌轉(zhuǎn)移灶成像

本文要點(diǎn)：食管鱗狀細(xì)胞癌 (ESCC) 死亡率高，其主要治療方法是手術(shù)切除。由于高度侵襲性，ESCC 在食管壁和淋巴系統(tǒng)中的浸潤(rùn)率很高，使得根治性手術(shù)對(duì) ESCC 來(lái)說(shuō)是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。目前，ESCC 患者的預(yù)后較差，5 年生存率為 30.3% 。因此，明確界定細(xì)微病變對(duì)于改善 ESCC 患者的預(yù)后至關(guān)重要。在本研究中，旨在探討 EGFR （表皮生長(zhǎng)因子受體）靶向抗體探針的 NIR-II 手術(shù)導(dǎo)航對(duì) ESCC 的價(jià)值。首先，結(jié)果證實(shí) EGFR 在 ESCC 細(xì)胞系和樣品中過(guò)表達(dá)。然后構(gòu)建了 NIRF 探針西妥昔單抗-IR800。體外和體內(nèi)研究顯示 EGFR 抗體探針在 ESCC 中的特異性攝取。此外，西妥昔單抗-IR800 用于 NIR-I 和 NIR-II 窗口中原位 ESCC 模型的手術(shù)導(dǎo)航。因此，該研究結(jié)果強(qiáng)調(diào) NIR-II 成像可以幫助識(shí)別微轉(zhuǎn)移。

 

 

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首先，檢測(cè) EGFR 在患者腫瘤中的臨床相關(guān)性，并通過(guò) IHC 研究 127 名原發(fā)性 ESCC 患者和相應(yīng)淋巴結(jié)中的 EGFR 表達(dá)。如圖 1A 和 C 數(shù)據(jù)顯示，在 94.49% 的原發(fā)性 ESCC 患者和 90.63% 的 LNM 患者中發(fā)現(xiàn)了陽(yáng)性 EGFR 染色。EGFR 在 ESCC 組織中的過(guò)表達(dá)率達(dá)到73.23% ，在 LNMs 中達(dá)到81.25% 。如圖 1B 和D數(shù)據(jù)顯示，腫瘤組織中和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中 EGFR 的表達(dá)顯著高于相鄰正常組織（H 評(píng)分）。如表 1 所示，EGFR 表達(dá)與年齡、性別、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期或組織學(xué)分化無(wú)關(guān)。

圖 1. ESCC 患者腫瘤組織和淋巴結(jié)的免疫組織化學(xué)（A,C）ESCC 患者的代表性 EGFR 染色圖像（A）腫瘤組織和（C）淋巴結(jié)的代表性 EGFR 染色圖像（-：陰性染色，+：弱陽(yáng)性，++：中等陽(yáng)性，+++：強(qiáng)陽(yáng)性） (B) 正常組織和腫瘤組織的 H 分?jǐn)?shù)比較（H值大于100被歸為“過(guò)度表達(dá)”）(D) 正常和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的 H 評(píng)分比較

 

表1：ESCC 中的 EGFR 表達(dá)特征

 

其次，研究EGFR的表達(dá)和西妥昔單抗與癌細(xì)胞的結(jié)合。使用蛋白質(zhì)印跡評(píng)估 ESCC 細(xì)胞中的 EGFR 蛋白表達(dá)（圖 2A）。定量分析顯示 EGFR 蛋白在 KYSE-30 中的表達(dá)最高。因此，KYSE-30 被選為 EGFR 陽(yáng)性細(xì)胞系進(jìn)行體外和體內(nèi)研究，相反卵巢癌細(xì)胞系 A2780 被用作陰性對(duì)照（圖 2B）。共聚焦成像顯示 EGFR 蛋白主要分布在 KYSE-30 細(xì)胞的膜和細(xì)胞質(zhì)中，而在 A2780 細(xì)胞中檢測(cè)不到該蛋白（圖 2E）。西妥昔單抗的體外特異性是通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估，熒光強(qiáng)度峰的相對(duì)位移表明西妥昔單抗-IR800 與 EGFR 陽(yáng)性 KYSE-30 細(xì)胞結(jié)合，但不與 EGFR 低表達(dá)的 A2780 細(xì)胞結(jié)合（圖2C）。這些結(jié)果表明 EGFR 可作為 ESCC 成像的有吸引力的靶標(biāo)。正如預(yù)期的那樣，西妥昔單抗和西妥昔單抗-IR800的結(jié)合能力沒(méi)有顯著差異，表明染料標(biāo)記后西妥昔單抗的結(jié)合不受影響（圖2C，D）。共焦顯微成像用于評(píng)估探針與細(xì)胞的結(jié)合，EGFR  陽(yáng)性細(xì)胞系 KYSE-30 與西妥昔單抗-IR800 在室溫下孵育 0.5 h 時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的膜熒光，這進(jìn)一步表明西妥昔單抗-IR800 的細(xì)胞結(jié)合是由 EGFR 介導(dǎo)的（圖 2E）。

圖 2. EGFR 的表達(dá)和西妥昔單抗與癌細(xì)胞系的結(jié)合 (A) 蛋白質(zhì)印跡用于確定 ESCC 細(xì)胞系和陰性對(duì)照卵巢癌細(xì)胞系中的 EGFR 表達(dá) (B) ESCC 細(xì)胞系中 EGFR 表達(dá)的量化 (C, D) 流式細(xì)胞儀分析和量化染料標(biāo)記抗體或裸抗體的細(xì)胞結(jié)合。通過(guò)染料標(biāo)記的抗體或裸抗體的平均熒光強(qiáng)度 (MFI) 與 IgG1 的 MFI 的比值計(jì)算定量 (E) A2780 和 KYSE-30 細(xì)胞中 EGFR 抗體的細(xì)胞結(jié)合的共聚焦熒光成像

 

接著，對(duì)西妥昔單抗-IR800 和 IgG1-IR800 在 EGFR 陽(yáng)性皮下腫瘤模型中成像。EGFR 陽(yáng)性腫瘤小鼠靜脈注射西妥昔單抗-IR800后，熒光在上腹部積聚(0.5 h)，并在 72 小時(shí)達(dá)到峰值。TBR 從 6 小時(shí)的 1.58 ± 0.09 增加到 120 小時(shí)的 3.95 ± 0.10。然而，注射 IgG1-IR800 在腫瘤中產(chǎn)生微弱的熒光，自 24 小時(shí)以來(lái)有所下降。西妥昔單抗-IR800 產(chǎn)生的絕對(duì)熒光值和 TBR 明顯強(qiáng)于對(duì)照探針（圖 3A-C）。對(duì)小鼠器官和腫瘤進(jìn)行體外熒光成像，結(jié)果表明接受西妥昔單抗-IR800 的腫瘤比對(duì)照組熒光信號(hào)更強(qiáng)（圖 3D，3E）。IHC 染色證實(shí)了 KYSE-30 腫瘤組織中 EGFR 的高表達(dá)和成像結(jié)果（圖 3F）。冰凍切片免疫熒光顯示注射西妥昔單抗的腫瘤內(nèi)的熒光信號(hào) IR800 強(qiáng)于 IgG1-IR800，表明靶向探針在腫瘤組織中的特異性積累。

圖3. 注射西妥昔單抗-IR800或IgG1-IR800 的 KYSE-30 皮下腫瘤的體內(nèi)/體外成像和探針?lè)植?(A) 裸鼠注射前后的體內(nèi)成像 (B) 腫瘤熒光強(qiáng)度的量化 (C) TBR 的量化。TBR，腫瘤與背景的比率 (D) 在120 小時(shí)注射探針后腫瘤和主要器官的離體成像(1 心臟、2肝臟、3脾臟、4肺、5腎臟、6胃、7腸、8結(jié)腸、9腫瘤、10腦、11胰腺）(E) 量化腫瘤和主要器官的平均熒光強(qiáng)度 (F) KYSE-30 腫瘤組織和肌肉的 IHC 染色 (G) 使用免疫熒光檢測(cè)探針和 EGFR 蛋白的分布

 

緊接著，對(duì) EGFR 陽(yáng)性和 EGFR 陰性皮下腫瘤模型進(jìn)行紅外成像。西妥昔單抗-IR800 的特異性在 EGFR 陰性 A2780 腫瘤中進(jìn)一步評(píng)估，并與 EGFR 陽(yáng)性 KYSE-30 腫瘤進(jìn)行比較。注射靶向探針后，KYSE-30 腫瘤表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光，MFI 和 TBR 分別在 48 和 72 小時(shí)達(dá)到峰值。但 A2780 細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗-IR800的攝取較弱，6 h后 MFI 和 TBR 均顯著低于 KYSE-30 腫瘤（P < 0.05）。根據(jù)體內(nèi)性能，體外成像也顯示 KYSE-30 和 A2780 腫瘤之間存在顯著差異（圖 4A+E）。免疫熒光成像和 IHC 染色顯示 KYSE-30 腫瘤中 EGFR 的表達(dá)明顯強(qiáng)于 A2780 腫瘤（圖 4F，G），這表明 EGFR 的細(xì)胞表達(dá)在腫瘤中得以維持。此外，西妥昔單抗-IR800 在 KYSE-30 細(xì)胞中的分布與 EGFR 染色共定位并且強(qiáng)于 A2780 細(xì)胞（圖 4G）。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步暗示目標(biāo)探針的吸收是由 EGFR 誘導(dǎo)的。

圖 4. 注射西妥昔單抗-IR800 的 KYSE-30 和 A2780 皮下腫瘤的體內(nèi)/體外成像和探針的分布 (A) 注射西妥昔單抗-IR800 前后的裸鼠體內(nèi)成像 (B) 腫瘤熒光強(qiáng)度的量化 (C) TBR 的量化(D) 在 96 小時(shí)注射探針后腫瘤和主要器官的離體成像 (1 心臟、2 肝臟、3 肺、4 脾臟、5 腎臟、6 胃、7 腸、8 結(jié)腸、9 皮膚、10 腫瘤、11胰腺，12 腦） (E) 量化腫瘤和主要器官的平均熒光強(qiáng)度 (F) 使用免疫熒光檢測(cè)探針和 EGFR 蛋白的分布 (G) KYSE-30 和 A2780 腫瘤組織中 EGFR 蛋白的免疫組織化學(xué)染色

 

然后，進(jìn)行 NIR-I 和 NIR-II 引導(dǎo)手術(shù)并比較，以驗(yàn)證西妥昔單抗-IR800 在 ESCC 中的價(jià)值。原位 ESCC 模型 (n = 9) 用于影像引導(dǎo)手術(shù)。手術(shù)導(dǎo)航前，9.4T T2加權(quán) MR 圖像用于掃描上腹部，顯示食管下段有高信號(hào)腫塊。食道壁增厚和管腔變窄與人類食道癌的特征一致（圖 5A）。在探針給藥后 72 小時(shí)進(jìn)行了剖腹探查，發(fā)現(xiàn)食管下壁有一個(gè)局灶性腫塊。相應(yīng)位置的生物發(fā)光信號(hào)進(jìn)一步證實(shí)了原位 ESCC 成功建立（圖5B）。進(jìn)行了原位 ESCC 腫瘤的 NIR-I 和 NIR-II 手術(shù)導(dǎo)航。NIR-II 的 TBR 遠(yuǎn)高于 NIR-I (2.11 ± 0.46 vs 1.58 ± 0.31, P <0.05)。TLR（腫瘤與肝臟的比率）的灰度值與 TBR 的灰度值一致（1.82 ± 0.44 vs 1.37 ± 0.25，P < 0.05）（圖 5C）。采集原位腫瘤進(jìn)行病理分析，包括 HE 和 IHC 染色。腫瘤侵犯食管肌層，鄰近組織有微小浸潤(rùn)。IHC 染色表明 EGFR 在原位腫瘤中高表達(dá)（圖 5D，E）。

圖 5. 原位食管鱗狀細(xì)胞癌的手術(shù)導(dǎo)航 (A) MR 成像顯示食管下壁增厚和管腔變窄 (B) 用 KYSE-30-L 細(xì)胞構(gòu)建的原位 ESCC 模型通過(guò)手術(shù)探查和生物發(fā)光得到證實(shí) (C)NIR-I 和 NIR-II導(dǎo)航以及 ESCC 在探針注射后 72 小時(shí)的 TBR 和 TLR（D，E）原位 ESCC 的 HE 和 IHC 染色

 

最后，測(cè)量 1-5 毫米的生物發(fā)光陽(yáng)性結(jié)節(jié)散布在原位 ESCC 周圍，這意味著微轉(zhuǎn)移（圖 6A，B）。NIR-II 成像突出了這些細(xì)微病變中的大部分，其中一些通過(guò)肉眼檢查和 NIR-I 成像無(wú)法辨別。連續(xù)灰度定量分析顯示 NIR-II 中有尖銳的信號(hào)峰，與轉(zhuǎn)移灶相對(duì)應(yīng)，而這些病灶的信號(hào)峰在 NIR-I 中較粗或丟失。定量分析顯示，NIR-II 中隱匿性轉(zhuǎn)移病灶的灰度值是 NIR-I 的 2.8 倍（62.6 vs 22.2），表明 NIR-II 成像在識(shí)別 ESCC 結(jié)節(jié)方面比 NIR-I 更有效，因?yàn)樵��?ESCC 中的 TBR 較高（圖 6C，D）。根據(jù)生物發(fā)光和 HE 染色，NIR-II 在檢測(cè)轉(zhuǎn)移灶的靈敏度方面優(yōu)于 NIR-I  (圖 6E-G)。此外，NIR-II 在原位 ESCC 附近劃定了細(xì)微結(jié)節(jié), 連續(xù)灰度定量分析也顯示了與原發(fā)腫瘤相鄰的小信號(hào)峰。連續(xù)灰度定量分析無(wú)法區(qū)分微小病變與原發(fā)性ESCC的信號(hào)，這些數(shù)據(jù)表明 NIR-II 比 NIR-I 具有更好的空間分辨率。

圖 6. 轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的手術(shù)導(dǎo)航 (A) 剖腹術(shù)顯示食管下壁增厚 (B) 生物發(fā)光成像顯示食管下段腫瘤和腹腔轉(zhuǎn)移（C，D）箭頭對(duì)應(yīng)于 NIR-I 和 NIR-II 區(qū)域的橫截面熒光強(qiáng)度分布的位置和方向，定量分析結(jié)果表明，與 NIR-I 相比，NIR-II 成像對(duì) ESCC 轉(zhuǎn)移的區(qū)分更有效 (E, F) 小轉(zhuǎn)移瘤的 HE 和 IHC 分析 (G) NIR-I 和 NIR-II 檢測(cè)到的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量

 

 

參考文獻(xiàn)
doi: 10.1021/acs.molpharmaceut.2c00115.

 

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