同位素內(nèi)標(biāo)在94份玉米中6類真菌毒素檢測及污染情況分析的應(yīng)用
摘要：建立了玉米的一步法提取6類真菌毒素同時檢測的分析方法，共分析了96份玉米中6類真菌毒素的污染情況及地域分布情況，為監(jiān)測飼料質(zhì)量提供技術(shù)指導(dǎo)。稱取的樣品添加6類真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)，以84%乙腈水和50%甲醇水作為提取試劑，以2mM乙酸銨0.1%甲酸水溶液和甲醇/乙腈和水為流動相梯度洗脫，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測。94份玉米中6類真菌毒素的檢出率為98%，單種毒素檢出率最高的是伏馬毒素B1和B2，高達(dá)88%，嘔吐毒素和赭曲霉毒素A檢出率最低，均未檢出。伏馬毒素B1和B2、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的最高殘留量分別是89.1mg/kg、76.4ug/kg、3.95×103mg/kg和7.0mg/kg。地域分布上具有分布范圍廣，污染較嚴(yán)重的特點(diǎn)。建立的6類真菌毒素檢測方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，結(jié)果分析對玉米中真菌毒素污染檢測和防控具有重要意義。
關(guān)鍵詞：真菌毒素、液相色譜--串聯(lián)質(zhì)譜、污染情況、真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)
真菌毒素屬于真菌的代謝產(chǎn)物，幾乎可以污染所有的農(nóng)作物，會損害動物體的肝臟、腎臟及皮膚組織等，進(jìn)而通過食物鏈的形式影響到人體的健康。[1]已知的真菌毒素多達(dá)300種以上，目前多個國家均建立了飼料中真菌毒素的限量要求，[2-3]我國已于2017年推出國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)GB 13078-2017飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，并于2018年實(shí)施，其對黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏馬毒素B1和B2、T-2毒素等做出明確的檢測方法規(guī)定和限量要求。本文采用94份玉米為樣本，對這6類真菌毒素進(jìn)行檢測方法開發(fā)和污染情況分析。為多毒素的快速檢測提供技術(shù)支持的同時，也為飼料中真菌毒素污染的監(jiān)測和防控提供幫助。本文采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，通過加入同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正的手段，開發(fā)6類真菌毒素的檢測方法，并對94份玉米樣品進(jìn)行6類真菌毒素的檢測及污染情況分析。
1 材料
1.1儀器
TSQ Quantis液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、KS-7200DE超聲波提取儀和TGL-16M高速冷凍離心機(jī)1.2試劑 真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品：黃曲霉毒素B1（貨號：STD#1052）、嘔吐毒素（貨號：STD#3102）、玉米赤霉烯酮（貨號：STD#4012）、赭曲霉毒素A（貨號：STD#5012）、伏馬毒素B1和B2（貨號：STD#2013）和T-2毒素（貨號：STD#3111）
真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)：黃曲霉毒素B1同位素內(nèi)標(biāo)（貨號：STD#1041U）、嘔吐毒素同位素內(nèi)標(biāo)（貨號：STD#3101U）、玉米赤霉烯酮同位素內(nèi)標(biāo)（貨號：STD#4010U）、赭曲霉毒素A同位素內(nèi)標(biāo)（貨號：STD#5010U）、伏馬毒素B1同位素內(nèi)標(biāo)（貨號：STD#2030U）、伏馬毒素B2同位素內(nèi)標(biāo)（貨號：STD#2040U）和T-2毒素同位素內(nèi)標(biāo)（貨號：STD#3110U）
1.3樣品
96份玉米種類及地域分布（樣品來源于全國近30個省份及地區(qū)）
96份玉米種類涉及青農(nóng)1801、鄭單958、萬盛189、登海W189、洛玉16、中選777等。依據(jù)我國區(qū)域劃分方式將94份玉米的分布區(qū)域進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)
|
區(qū)域 |
省份 |
份數(shù) |
|
華東地區(qū) |
山東、江蘇、安徽、浙江、福建、上海
|
22 |
|
華南地區(qū) |
廣東、廣西、海南 |
10 |
|
華中地區(qū) |
湖南、湖北、河南、江西 |
12 |
|
華北地區(qū) |
北京、天津、河北、山西、內(nèi)蒙古 |
17 |
|
西南地區(qū) |
四川、云南、西藏、重慶 |
12 |
|
西北地區(qū) |
寧夏、新疆、青海、陜西、甘肅 |
10 |
|
東北地區(qū) |
黑龍江、吉林、遼寧 |
11 |
2 方法
2.1色譜及質(zhì)譜條件：
色譜柱： Hypersil GOLD C18 （100*2.1 3um）
流動相： 2mM乙酸銨0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脫伏馬毒素B1和B2、黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和T-2毒素/乙腈水梯度洗脫嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮
梯度表1
|
時間 |
流速mL/min |
2mM乙酸銨0.1%甲酸水 |
甲醇 |
|
0 |
0.3 |
70 |
30 |
|
1 |
0.3 |
70 |
30 |
|
3.5 |
0.3 |
30 |
70 |
|
4 |
0.3 |
30 |
70 |
|
5 |
0.3 |
5 |
95 |
|
9 |
0.3 |
5 |
95 |
|
10 |
0.3 |
70 |
30 |
梯度表2
|
時間 |
流速mL/min |
水 |
乙腈 |
|
0 |
0.3 |
70 |
30 |
|
1 |
0.3 |
70 |
30 |
|
3.5 |
0.3 |
30 |
70 |
|
4 |
0.3 |
30 |
70 |
|
5 |
0.3 |
5 |
95 |
|
9 |
0.3 |
5 |
95 |
|
10 |
0.3 |
30 |
70 |
采用ESI離子源，分別用正離子模式掃描和負(fù)離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）采集數(shù)據(jù)，6類真菌毒素及其對應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見下表：
6類真菌毒素及其對應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)
|
毒素名稱 |
母離子m/z |
子離子m/z |
碰撞電壓/V |
射頻透鏡 電壓/V |
采集模式 |
|
FB1 |
722.3 |
334/352 |
40/36 |
279 |
[M+H]+ |
|
13C-FB1 |
756 |
356/373/374/737 |
39/34/35/26 |
180 |
[M+H]+ |
|
FB2 |
706.35 |
318/336 |
35/39 |
243 |
[M+H]+ |
|
13C-FB2 |
740.7 |
340/358/376/723 |
40/38/34/28 |
216 |
[M+H]+ |
|
AFB1 |
313.1 |
241/269/285 |
38/32/23 |
176 |
[M+H]+ |
|
13C-AFB1 |
330 |
255/284/301 |
39.7/32.8/24.1 |
181 |
[M+H]+ |
|
OTA |
404.088 |
193/221/239/241/358 |
43/37/24/20/15 |
143 |
[M+H]+ |
|
13C-OTA |
424 |
250/377 |
27/14 |
140 |
[M+H]+ |
|
T-2 |
484.21 |
185/215/305 |
22/19/13 |
109 |
[M+NH4]+ |
|
毒素名稱 |
母離子m/z |
子離子m/z |
碰撞電壓/V |
射頻透鏡電壓/V |
采集模式 |
|
13C-T-2 |
508.4 |
198/229/322 |
22/19/14 |
121 |
[M+NH4]+ |
|
DON |
295 |
138/265 |
17/12 |
109 |
[M-H]- |
|
13C-DON |
310 |
145/279 |
14/12 |
109 |
[M-H]- |
|
ZON |
317 |
131/175/273 |
30/24/19 |
170 |
[M-H]- |
|
13C-ZON |
335 |
140/185/290 |
31/25/19 |
178 |
[M-H]- |
注：FB1為伏馬毒素B1簡寫（下同），F(xiàn)B2為伏馬毒素B2簡寫，AFB1為黃曲霉毒素B1簡寫，OTA為赭曲霉毒素A簡寫，T-2位T-2毒素簡寫，DON為嘔吐毒素簡寫，ZON為玉米赤霉烯酮簡寫；13C為其相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)簡寫
2.2標(biāo)準(zhǔn)品的配制
2.2.1混合標(biāo)準(zhǔn)品配制：配制伏馬毒素B1和B2濃度為2.4ppm、黃曲霉毒素B1濃度為80ppb、玉米赤霉烯酮1.6ppm、嘔吐毒素3.2ppm、T-2毒素1.6ppm、OTA160ppb的混標(biāo)
2.2.2同位素內(nèi)標(biāo)配制：配制伏馬毒素B1和B2濃度為240ppb、黃曲霉毒素B1濃度為8ppb、玉米赤霉烯酮160ppb、嘔吐毒素320ppb、T-2毒素160ppb、OTA16ppb的同位素內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)品
2.3樣品處理
稱取5g樣品各兩份，加入同位素內(nèi)標(biāo)100uL，其中一份加入20mL84%乙腈水，另一份加入20mL50%甲醇水，超聲波震蕩提取20min，6000r/min離心5min，上清液過0.22um有機(jī)濾膜，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測。
3.結(jié)果分析
3.1譜圖
FB1、FB2、AFB1、OTA和T-2的外標(biāo)及同位素內(nèi)標(biāo)的MRM圖
DON和ZON的外標(biāo)及同位素內(nèi)標(biāo)的MRM圖
3.2回收率
|
項(xiàng)目 |
FB1 |
FB2 |
AFB1 |
ZON |
DON |
T-2 |
OTA |
|
添加水平 |
600ng/g |
600ng/g |
20ng/g |
400ng/g |
800ng/g |
400ng/g |
40ng/g |
|
回收率 |
83.6% |
80.4% |
101.8% |
109.8% |
88.0% |
91.3% |
86.9% |
3.3線性
|
項(xiàng)目 |
相關(guān)系數(shù) |
線性范圍/ng |
線性方程 |
|
FB1 |
0.9991 |
0.19-100 |
y = 219.68x - 1206.9 |
|
FB2 |
0.9996 |
0.19-100 |
y = 911.45x - 1989.7 |
|
AFB1 |
0.9993 |
0.049-40 |
y = 61482x + 6.8125 |
|
ZON |
0.9995 |
0.094-35 |
y = 8008.3x - 42517 |
|
DON |
0.9999 |
2-450 |
y = 2755.5x - 796.14 |
|
T-2 |
0.9994 |
0.1-100 |
y = 110254x - 63112 |
|
OTA |
0.9997 |
0.01-20 |
y = 1824.1x + 1.5954 |
3.4整體污染情況
對96份玉米的6類真菌毒素檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總，所有樣品均未檢出赭曲霉毒素和T-2毒素。96份玉米中有2份玉米不含有這6類真菌毒素，10份玉米只含有1類真菌毒素，32份玉米含有2類真菌毒素，44份玉米含有3類真菌毒素，6份玉米含有4類真菌毒素。
污染情況占比圖
3.5區(qū)域分布情況
依據(jù)94份樣品分布區(qū)域進(jìn)行劃分，對6種真菌毒素進(jìn)行分析匯總（匯總表見下），西北地區(qū)玉米受真菌毒素污染的種類最少，污染程度最低；華中地區(qū)、華北地區(qū)、西南地區(qū)和東北地區(qū)毒素污染情況較重；華東地區(qū)和華南地區(qū)玉米受真菌毒素污染的種類和程度最高。
|
毒素種類 |
華東 |
華南 |
華中 |
華北 |
西南 |
西北 |
東北 |
總計(jì) |
|
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
2 |
0 |
2 |
|
1 |
2 |
0 |
0 |
1 |
1 |
5 |
1 |
10 |
|
2 |
6 |
2 |
6 |
7 |
4 |
1 |
6 |
32 |
|
3 |
13 |
5 |
6 |
9 |
5 |
2 |
4 |
44 |
|
4 |
1 |
3 |
0 |
0 |
2 |
0 |
0 |
6 |
|
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
6 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
總計(jì) |
22 |
10 |
12 |
17 |
12 |
10 |
11 |
94 |
3.6超限情況
3.6.1
對96份玉米的6類真菌毒素檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總，依據(jù)GB 13078-2017 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)限量要求進(jìn)行超限判斷（表1），超限樣品共計(jì)14份，其中9份樣品一類真菌毒素超限，剩余5份樣品兩類真菌毒素超限。針對赭曲霉毒素和T-2毒素含量，所有樣品均合格；此外，其余毒素超限情況如下：伏馬毒素B1+B2、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的超限樣品份數(shù)分別為：3份、2份、11份和3份，其對應(yīng)的超限率分別為3.2%、2.1%、11.7%和3.2%。
表1 部分飼料原料中6類真菌毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)及限量要求
|
項(xiàng)目 |
產(chǎn)品名稱 |
檢測標(biāo)準(zhǔn) |
限量 |
|
黃曲霉毒素B1 |
玉米加工產(chǎn)品、花生餅 |
NY/T 2071 |
≤50ug/kg |
|
赭曲霉毒素A |
谷物及其加工產(chǎn)品 |
GB/T 30957 |
≤100ug/kg |
|
玉米赤霉烯酮 |
玉米及其加工產(chǎn)品 |
NY/T 2071 |
≤0.5mg/kg |
|
嘔吐毒素 |
植物性飼料原料 |
GB/T 30956 |
≤5mg/kg |
|
T-2毒素 |
植物性飼料原料 |
NY/T 2071 |
≤0.5mg/kg |
|
伏馬毒素B1+2 |
玉米及其加工產(chǎn)品 |
NY/T 1970 |
≤60mg/kg |
3.6.2
對96份玉米的6類真菌毒素檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總，依據(jù)GB 2761-2017 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量要求進(jìn)行超限判斷（表2），超限樣品共計(jì)46份，其中25份樣品一類真菌毒素超限，剩余21份樣品兩類真菌毒素超限。針對赭曲霉毒素含量，所有樣品均合格；此外，其余毒素超限情況如下：黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的超限樣品份數(shù)分別為：4份、35份和28份，其對應(yīng)的超限率分別為4.3%、37.2%和29.8%。
表2 部分食品中6類真菌毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)及限量要求
|
項(xiàng)目 |
食品類別 |
檢驗(yàn)方法 |
限量 |
|
黃曲霉毒素B1 |
玉米、玉米面及玉米制品 |
GB 5009.22 |
20ug/kg |
|
赭曲霉毒素A |
谷物及其制品 |
GB 5009.96 |
5.0ug/kg |
|
玉米赤霉烯酮 |
玉米、玉米面（渣、片） |
GB 5009.209 |
60ug/kg |
|
嘔吐毒素 |
玉米、玉米面（渣、片） |
GB 5009.111 |
1000ug/kg |
3.7 單類毒素分析
由于所有樣品均未檢出赭曲霉毒素和T-2毒素，故只對其余四類真菌毒素進(jìn)行單獨(dú)分析94份玉米中6類毒素污染情況對比圖
3.7.1 伏馬毒素B1+B2
對96份玉米的伏馬毒素B1和B2檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總，有檢出樣品數(shù)量為88份，占比93.6%，檢測結(jié)果在0.0503mg/kg-89.1mg/kg，中位值為6.41mg/kg；整體污染水平為10.9mg/kg，陽性污染水平為11.6mg/kg。
3.7.2 黃曲霉毒素B1
對96份玉米的黃曲霉毒素B1檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總，有檢出樣品數(shù)量為29份，占比30.9%，檢測結(jié)果在2.20ug/kg-76.4ug/kg，中位值為4.58ug/kg；整體污染水平為3.48ug/kg，陽性污染水平為11.3ug/kg。
3.7.3 玉米赤霉烯酮
對96份玉米的玉米赤霉烯酮檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總，有檢出樣品數(shù)量為56份，占比59.6%，檢測結(jié)果在10.6mg/kg-3.95×103mg/kg，中位值為98.3mg/kg；整體污染水平為329mg/kg，陽性污染水平為552mg/kg。
3.7.4 嘔吐毒素
對96份玉米的嘔吐毒素檢測結(jié)果進(jìn)行分析匯總，有檢出樣品數(shù)量為56份，占比59.6%，檢測結(jié)果在0.1mg/kg-7.0mg/kg，中位值為1.0mg/kg；整體污染水平為0.8mg/kg，陽性污染水平為1.4mg/kg。
4討論
目前，從技術(shù)角度講，飼料中真菌毒素檢測共涉及到6大類，檢測標(biāo)準(zhǔn)4項(xiàng)，前處理方法不一，凈化產(chǎn)品各異，對人員、操作、設(shè)備要求苛刻，給檢測帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)；從污染根源分析，一種真菌可能產(chǎn)生多種毒素，一種原料會受到多種真菌感染，往往是單個飼料樣品需要檢測多種真菌毒素；從現(xiàn)實(shí)情況來看，飼料受真菌毒素污染情況較嚴(yán)重，且分布不均勻，需要加強(qiáng)其毒素監(jiān)測。本文所述的一步法檢測，采用直提的方式，同位素校正的手段，在保證結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，最大程度降低操作難度，縮短檢測周期，同時也控制了實(shí)驗(yàn)成本。
綜上，本文不僅為飼料中6類真菌毒素的檢測提供有效的方法支撐，同時也為飼料中真菌毒素殘留的檢測方向提供指導(dǎo)，為保證飼料產(chǎn)品的質(zhì)量提供幫助。
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