利用高效液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行丹參多酚酸SLI的活性成分鑒定

注射用丹參多酚酸(SLI)是一種從丹參水提物中提取的凍干粉針劑，由丹參水溶性提取物制成。它具有活血通絡(luò)、抗炎、抗氧化、神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)等功能。在臨床上，它經(jīng)常用于治療中風(fēng)恢復(fù)期經(jīng)絡(luò)中的血瘀和側(cè)支阻塞綜合征（輕度至中度腦梗死）。由于SLI是一種成分復(fù)雜的中藥注射劑，其臨床應(yīng)用的安全性一直是以往研究中不可避免的話題。迄今為止，如何全面表征 SLI 的活性成份，特別是具有潛在生物活性的微量成分，仍然具有很大的挑戰(zhàn)。
 
天津中醫(yī)藥大學(xué)的研究學(xué)者通過QTRAP^® 系統(tǒng)獨(dú)特的多種采集模式復(fù)合聯(lián)用的方式，采用四種掃描模式（EMS-IDA-EPI，Pre-IDA-EPI，NL-IDA-EPI，pMRM-IDA-EPI）互為補(bǔ)充的新策略，并結(jié)合LightSight™軟件自動(dòng)預(yù)測相似結(jié)構(gòu)未知物的功能，提出了一種新穎、靈敏且簡單的策略，用于系統(tǒng)、高效、快速的分析鑒定SLI中的活性成分。

從 SLI 中鑒定出總共 171 種化合物。其中，27個(gè)痕量成分以前沒有報(bào)道過。這種策略可以顯著提高對于SLI中大量痕量活性成份的鑒定及異構(gòu)體的區(qū)分，從而全面的鑒定到SLI中不同含量分布的活性成份。另外，對定性結(jié)果選出的13個(gè)代表性成份在15批次SLI中進(jìn)行準(zhǔn)確定量。其中，丹酚酸 A (Sal A)、Sal B、Sal D、紫精酸 (LA) 和迷迭香酸 (RA) 被證明是主要成分。

研究表明，這種新策略可以顯著提高對于未發(fā)現(xiàn)的化學(xué)成分的鑒定，為鑒定其它中藥的有效成分提供了很好的思路。
 
SCIEX超高效液相 ExionLC™ AD系統(tǒng)聯(lián)用SCIEX Triple Quad™ 7500系統(tǒng)-QTRAP® Ready(四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜系統(tǒng))
 
樣品信息：

樣品：制備樣品SLI時(shí)，用1 mL超純水稀釋。離心，過濾，上機(jī)分析。

標(biāo)準(zhǔn)品信息：

標(biāo)準(zhǔn)品：丹參素、咖啡酸、阿魏酸、異芥酸、丹酚酸C、原兒茶酸、紫草酸、香草醛酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸D、原兒茶酸醛、迷迭香酸。

通過將標(biāo)準(zhǔn)溶液與10%ACN的混合物連續(xù)稀釋，制備了一系列工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。
1. 定性結(jié)果

1.2 SLI的四種掃描模式匯總結(jié)果
 
如圖3所示，將pMRM、EMS、Prec和NL四種采集方式進(jìn)行了韋恩圖匯總，表明四種采集方式均有各自的優(yōu)勢。在這四種掃描模式的幫助下，共鑒定到171種成分（詳見原文），其中12種與標(biāo)準(zhǔn)品對照確認(rèn)，保證鑒定準(zhǔn)確度。由于pMRM 模式出色的靈敏度和選擇性，可鑒定多達(dá)168 種化合物。EMS掃描模式排在第二位，檢測到 76 種成分；Prec 和NL掃描模式大約有30個(gè)成份。這些成份主要分為以下類型：單體、二聚體、三聚體、四聚體酚酸及其異構(gòu)體和衍生物（即糖基化、烷基化、水解、脫氧、脫羧、脫氫、氧化等）。此外，27種痕量成分以前從未報(bào)告過。

根據(jù)QTRAP質(zhì)譜的復(fù)合式掃描方式，首先使用基于QTRAP質(zhì)譜的EMS-IDA-EPI 掃描來獲取非靶向化學(xué)信息，可以全面挖掘分析物的MS碎片信息。然后利用代表性組分的典型碎片離子進(jìn)行半靶向的Prec和NL-IDA-EPI 掃描，可以選擇性地檢測與母核結(jié)構(gòu)相似的化合物，從而得到更多結(jié)構(gòu)相關(guān)且含量相對較高的化合物。隨后，總結(jié)了碎片離子的特征和典型性，以及可能的衍生代謝途徑，開發(fā)出靈敏度和選擇性更高的pMRM-IDA-EPI 掃描方法，從而鑒定到不同濃度水平的活性成份，尤其是痕量化合物。因此，EMS、Prec和NL-IDA-EPI可以被視為pMRM-IDA-EPI 的有利補(bǔ)充策略，以獲取更多對結(jié)構(gòu)解析有用的片段信息。

如圖4所示，化合物48和50（圖4A和4B）通過EMS檢測到，而47和38（圖4C和4D）通過Prec（m/z109）和NL（198Da）分別檢測到。
 
SLI中的酚酸具有結(jié)構(gòu)相似但含量差異較大的特點(diǎn)。一些痕量成分，例如一系列酚酸衍生物，可能具有潛在的生物活性，但難以檢測。pMRM掃描模式作為一種靶向策略，靈敏度高，干擾少，一次進(jìn)樣即可同時(shí)檢測不同含量水平的組分。如圖5所示，以圖5A的化合物75為例，它們僅通過pMRM 掃描模式可以檢測到，并且根據(jù)碎片信息推測出甲酰化位點(diǎn)。該方法的高靈敏度還體現(xiàn)在異構(gòu)體的鑒定上，以化合物79 為例，本研究共鑒定出6種異構(gòu)體，pMRM均能檢測到，而Prec和NL均未檢測到。
 
2. 定量結(jié)果

2.1 13種標(biāo)準(zhǔn)品XIC提取離子流色譜圖請見圖6。
 
所有13種分析物均顯示出良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r值大于0.997。通過向樣品中添加低中高三個(gè)濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，從而考察本方法的回收率和精密度。對每種濃度水平進(jìn)行一式三份分析，目標(biāo)化合物的回收率在77.05%到99.30%之間，RSD值在0.45%到5.80%之間。

通過SLI的15批次樣本進(jìn)行定量分析，從圖7可以看出，13種成分的含量差別很大。丹酚酸A（Sal A）、Sal B、Sal D、紫草次酸（LA）和迷迭香酸（RA）是主要成分。其中，Sal B的含量最高（195.08-350.46μg/mg），然后是LA、Sal A和RA。但是，香草醛、阿魏酸、Sal C、原兒茶醛和原兒茶酸的含量較低，這些也是SLI的重要活性成分。
 
參考文獻(xiàn)：

Yaqing Guo, Rui Mao, Yuanyuan Zhang, Rongrong Li, Patrick Kwabena Oduro, Dandan Si, Lifeng Han, Yuhong Huang, Guixiang Pan. An integrated strategy for the systematic chemical characterization of Salvianolate lyophilized injection using four scan modes based on the ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole-linear ion trap mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 215 (2022) 114769 doi.org/10.1016/j.jpba.2022.114769;