AML12小鼠肝細胞的培養(yǎng)步驟及應(yīng)用

 一、細胞簡介：

　　細胞名稱：AML12小鼠肝細胞

　　平臺編號:zl-056994

　　細胞特性

　　1）來源：小鼠，肝

　　2）形態(tài)：上皮樣細胞

　　3）含量：>1x106個/mL

　　4）污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

　　5）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

　　二、細胞培養(yǎng)步驟

　　培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

　　1）準備DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；10ug/mL胰島素；轉(zhuǎn)鐵蛋白5.5ug/mL;5ng/mL硒;40ng/mL地塞米松;雙抗，1%。

　　2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

　　3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　細胞處理：

　　1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?50px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

　　2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

　　對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

　　1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

　　2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

　　3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

　　4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

　　注：第一次傳代推薦傳代比例為1:2，以后傳代比例可根據(jù)客戶需要自己決定。

　　3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。

　　三、用于載鉛超細炭黑對CAT、SOD及小鼠肝細胞毒性效應(yīng)與機理的研究

　　選取小鼠原代肝細胞為靶細胞,選取CAT和SOD為靶蛋白,選取UFCB作為UFPs的生物替代模型,在細胞水平和分子水平研究比對了UFCB和載鉛UFCB誘發(fā)機體氧化應(yīng)激的效應(yīng)與機理。

　　主要包括以下幾部分內(nèi)容:（1）綜述了大氣顆粒物、UFPs、UFCB和鉛的污染現(xiàn)狀及現(xiàn)階段毒理學研究進展,明確了現(xiàn)階段對載鉛UFPs毒性機理評價的不足,確定了本次的研究目的和研究內(nèi)容。

　�。�2）利用多種方法對UFCB進行改性修飾,改性后超細炭黑（MCB）水溶液的Zeta電位為-39.7mV,遠高于改性之前的-18.2mV,證明MCB的分散穩(wěn)定性優(yōu)于改性之前。將MCB應(yīng)用于鉛的吸附實驗,最后得到鉛含量為0.235g/g的載鉛MCB（即Pb-MCB）。

　�。�3）研究比對了MCB和Pb-MCB誘發(fā)小鼠肝細胞氧化應(yīng)激效應(yīng)的影響。實驗結(jié)果表明:肝細胞活力與MCB和Pb-MCB暴露濃度之間均呈負活力-劑量關(guān)系。細胞內(nèi)MDA含量隨MCB和Pb-MCB暴露濃度的增加而升高,且在50mg/L時達到最高,分別為對照組的204.44%和172.49%,高濃度的MDA打破了細胞內(nèi)部的氧化還原平衡并破壞了細胞膜的完整性,使細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用從而導致細胞活力降低甚至死亡。隨著MCB和Pb-MCB暴露濃度的升高,細胞內(nèi)CAT的相對活力均呈先上升后下降的趨勢。MCB的暴露同樣導致了胞內(nèi)SOD的相對活性先上升后下降,但是隨Pb-MCB暴露濃度的增加,SOD的相對活性逐步上升。比對同等暴露條件下MCB和Pb-MCB對小鼠肝細胞氧化應(yīng)激指標的影響發(fā)現(xiàn),MCB的細胞毒性較Pb-MCB的細胞毒性強,原因是MCB較Pb-MCB帶更多的負電荷,更易與膜蛋白、CAT和SOD結(jié)合作用,影響細胞和酶的活力及功能表達。

　�。�4）利用多種光譜學手段研究比對了MCB和Pb-MCB的暴露對CAT和SOD分子結(jié)構(gòu)和功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):無論是MCB還是Pb-MCB都會與CAT和SOD結(jié)合,在炭黑顆粒表面形成一層“蛋白冠”類的物質(zhì),改變了CAT和SOD發(fā)色團的微環(huán)境,使蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)緊縮,疏水性增強。MCB和Pb-MCB暴露染毒均使CAT的活性先上升后下降,使SOD的活性持續(xù)下降。CAT和SOD活性的變化一方面說明了結(jié)構(gòu)的改變影響了酶的功能表達;另一方面酶與MCB或Pb-MCB的結(jié)合會影響其活性位點附近氨基酸的微環(huán)境,從而間接對酶的活性產(chǎn)生影響或者抑制作用。

　　比對同等暴露條件下MCB和Pb-MCB對CAT和SOD分子的影響時發(fā)現(xiàn),MCB對CAT和SOD結(jié)構(gòu)和功能的影響大于Pb-MCB對兩種酶蛋白的影響,原因是MCB帶大量的負電荷,更易與帶正電荷的CAT或者SOD結(jié)合作用,改變酶蛋白的結(jié)構(gòu)使其活性降低;而Pb-MCB溶液中微量Pb2+的存在促進了Pb-MCB粒子的團聚沉降,粒徑的增大使Pb-MCB與酶蛋白之間的作用力和結(jié)合面積減小,因此MCB較Pb-MCB表現(xiàn)出更強的分子毒性。