手術(shù)導航應用:NIR-IIb分子熒光成像引導下的低細胞水平高精度腫瘤切除

本文要點：一個多世紀以來，腫瘤切除手術(shù)一直依賴醫(yī)生的視覺反饋和經(jīng)驗來識別惡性組織和健康組織之間的邊界，這容易留下殘留癌細胞或者會過度移除健康組織。在根治性前列腺切除術(shù)、胰十二指腸切除術(shù)、乳腺癌和高級膠質(zhì)瘤切除術(shù)中有8%-70%的病例出現(xiàn)腫瘤殘留，導致局部癌癥復發(fā)。MRI、CT或X射線可用于改善術(shù)前成像，但不適用于術(shù)中實時導航，所以需要一種可用于術(shù)中且可在少數(shù)細胞水平切除殘留腫瘤的高空間分辨率成像方式。

 

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本文中作者開發(fā)了一種小型成像儀，用于同時進行可見光下攝影和NIR-II熒光成像，用于臨床上成像引導手術(shù)。同時利用在NIR -IIb區(qū)發(fā)光的具有生物相容性的鉺元素稀土納米顆粒（ErNPs），它連接上TRC105抗體后，用于4T1小鼠乳腺腫瘤中CD105（內(nèi)皮糖蛋白）血管生成標記物的分子成像。此成像方式可清晰地分辨腫瘤邊緣以及少量殘留癌細胞，從而實現(xiàn)在少數(shù)細胞水平上徹底且非過度地切除腫瘤。

 

作者集成使用可見光攝影的彩色相機和NIR-II區(qū)相機，構(gòu)建了一個便攜式成像儀。這兩臺相機使用了兩條由二向色鏡隔開的成像路徑，并共用相同的成像鏡頭組，以便于實時疊加攝影和熒光圖像。具有連續(xù)可變放大倍數(shù)的可變焦鏡頭組用于大視場（FOV）成像，并可切換使用5倍物鏡達到更高分辨率。808nm激光或940nm LED用于激發(fā)熒光。RGB-LED作為室內(nèi)光線用于彩色成像，因為作者觀察到RGB-LED對NIR-I和NIR-II熒光成像的影響可以忽略不計（圖1A）。 

 

TRC105是一種人源化的處于臨床階段的單克隆抗體，可與內(nèi)皮糖蛋白CD105結(jié)合，故可于高CD105表達的人類和小鼠腫瘤血管特異性結(jié)合。作者將TRC105分別與I期臨床試驗熒光團IRDye800CW和ErNPs結(jié)合，形成IRDye800抗體結(jié)合物（IRDye800-TRC105）和ErNPs抗體結(jié)合物（ErNPs-TRC105）（圖1B）。IRDye800-TRC105作為對照物在NIR-I和NIRII成像，ErNPs-TRC105在NIR-IIb區(qū)成像（1500-1700nm），激發(fā)波長為940nm（圖1C）。

 

圖1. （A）用于同時進行彩色成像和NIR-II成像的便攜式成像儀的照片和示意圖（B）ErNPs-TRC105的組成示意圖（C）ErNPs-TRC105的吸收-發(fā)射光譜

 

在BALB/c小鼠的左后肢或右后肢接種4T1小鼠乳腺腫瘤后，待腫瘤達到一定大小，靜脈注射IRDye800-TRC105或ErNPs-TRC105。IRDye800-TRC105在NIR-I區(qū)和NIR-IIa區(qū)成像，ErNPs-TRC105在NIR-IIb區(qū)成像。注射后10分鐘，在小鼠全身觀察到IRDye800-TRC105信號，而ErNPs-TRC105的信號集中在小鼠血管。隨著時間的推移，IRDye800-TRC105和ErNPs-TRC105在4T1腫瘤中的熒光信號增加，表明探針可靶向腫瘤血管。24h后，ErNPs-TRC105的背景信號較IRDye800-TRC105低，SBR更高（圖2AB）。ErNPs-TRC105的T/NT達到40，比IRDye800-TRC105的4.4（NIR-I）和5.9（NIR-II）高得多。為了進一步證明ErNPs高度特異腫瘤靶向性，作者將ErNPs-TRC105的靜脈注射劑量降低了一個數(shù)量級，仍能在4T1腫瘤中獲得良好的成像，T/NT仍能達到40（圖2C）。

 

圖2. （A）靜脈注射IRDye800-TRC105（左和中）或ErNPs-TRC105（右）后不同時間點下攜帶4T1腫瘤的小鼠的熒光圖像（B）沿A中虛線的歸一化熒光強度分布 （C）各組T/NT比值

 

當接種在小鼠后肢的4T1腫瘤達到4到8mm，注射IRDye800-TRC105和ErNPs-TRC105后，作者進行成像下的腫瘤切除手術(shù)（圖3A）。對于使用IRDye800-TRC105的影像引導手術(shù)，我們首先移除覆蓋4T1腫瘤的皮膚，以暴露腫瘤和周圍組織。腫瘤邊緣在背景上清晰可見，但對比度較低。根據(jù)腫瘤和周圍肌肉的熒光強度計算T/M為2.5和3.6，分別在NIR-I和NIR-II（圖3C）。切除腫瘤之后，瘤床，皮膚和肌肉組織仍顯示出較高的背景熒光發(fā)射，因此很難有把握辨別出腫瘤的殘留物。

 

圖3.（A）（上）手術(shù)期間記錄的彩色圖像。靜脈注射IRDye800-TRC105 24小時后4T1腫瘤切除的NIR-I熒光成像（中）和NIR-II熒光成像（下）（B）沿圖A中虛線的歸一化熒光強度分布（C）NIR-I和NIR-II下Dye800-TRC105的T/M

 

對于ErNPs-TRC105進行類似的操作（圖4A），其在NIR-IIb下成像的T/M為300（圖4C），與IRDye800-TRC105的NIR-I和NIR-II成像相比，ErNPs-TRC105周圍組織的熒光更低，腫瘤邊緣的信號變化（接近零）更為劇烈，使得評估腫瘤邊緣更容易（圖4B）。作者有時會觀察到ErNPs-TRC105在腫瘤周圍區(qū)域的信號強于腫瘤中部區(qū)域，但不總是存在這種情況，熒光探針的分布可以反映出CD105在腫瘤上的表達位置（圖4A）。腫瘤切除后，將腫瘤切片，經(jīng)H&E染色和NIR-IIb成像，疊加兩者圖像顯示，ErNPs-TRC105信號確實位于H&E染色的腫瘤區(qū)域，而在正常組織區(qū)域很少被檢測到（圖4D）。

 

圖4. （A）手術(shù)期間記錄的彩色圖像（上）。靜脈注射ErNPs-TRC105 24小時后4T1腫瘤切除的NIR-IIb熒光成像（中）和兩者的重疊圖像（下）（B）沿圖A中虛線的歸一化熒光強度分布（C）ErNPs和ErNPs-TRC105的T/M（D）腫瘤切片的H&E染色情況和NIR-IIb成像

 

作者使用了最高放大倍數(shù)的可變焦鏡頭組來檢查與殘余腫瘤病變相關(guān)的殘余熒光信號（圖5AB），在NIR-IIb窗口中觀察到遠高于邊緣的熒光點。隨后作者換用5倍物鏡的高分辨率模式來檢查，觀察到含有數(shù)千個細胞的少量腫瘤殘留物，尺寸在微米級別（圖5CD）。在這種成像的指導下，作者切除了由ErNPs-TRC105標記的少量殘留病變，直到在原始腫瘤區(qū)域中未觀察到熒光信號（圖5E）。

 

總的來說，作者研發(fā)了一臺將可見光成像和NIR-IIb成像結(jié)合的成像儀器，利用連接了TRC105抗體的鉺元素稀土納米顆粒（ErNPs-TRC105），對小鼠的腫瘤進行NIR-IIb成像，相對于IRDye800CW可更清晰地顯示腫瘤邊緣。在ErNPs-TRC105的成像下還可實現(xiàn)在低細胞水平切除殘留腫瘤組織，避免傳統(tǒng)手術(shù)上腫瘤切除不完全的弊端。

 

圖5. （A）（B）在可變焦鏡頭組的最高放大倍數(shù)下觀察腫瘤初次切除后手術(shù)區(qū)域的彩色和NIR- IIb成像（C）5倍物鏡下觀察腫瘤初次切除后手術(shù)區(qū)域的彩色和NIR- IIb成像（D）C中沿虛線的歸一化熒光強度分布，顯示特征尺寸為38μm（E）切除腫瘤殘余組織后的成像

 

參考文獻
https://doi.org/10.1073/pnas.2123111119

 

 

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