酶抑制IC50試驗(yàn)研究原理和試驗(yàn)方法

1    酶抑制研究的重要性

藥物代謝的主要場所是肝臟，其中細(xì)胞色素 P450（CYP）酶為主要的代謝酶，其亞型 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、 CYP3A4參與了體內(nèi)80%以上的藥物代謝。CYP酶是一個(gè)多功能的酶系，在體內(nèi)具有可誘導(dǎo)性和可抑制性。該酶與藥物的相互作用能夠在所有的體內(nèi)過程（包括吸收、分布、代謝和排泄）中發(fā)生，其中以代謝過程最為突出，約占40%。

近年發(fā)現(xiàn)，藥物相互作用是臨床上產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)甚至死亡的主要原因之一。CYP參與的藥物相互作用主要包括兩種類型：酶抑制（enzyme inhibition）和酶誘導(dǎo)（enzyme induction）。酶抑制是指某些化合物能抑制肝臟藥物代謝酶的活性，導(dǎo)致聯(lián)合用藥時(shí)一些藥物代謝減慢，使得藥物的血藥濃度上升致毒性；酶誘導(dǎo)是指某些化合物能提高肝臟藥物代謝酶的活性，導(dǎo)致合同的藥物代謝速率加快，使得原藥的血藥濃度下降，使其療效降低或喪失。
 
為獲得更好的治療效果，聯(lián)合用藥在臨床治療中已非常普遍。然而，在獲得更好的療效的同時(shí)，常伴隨著由藥物-藥物相互作用（drug-drug interaction，DDI）引起的不良反應(yīng)事件的發(fā)生。如特非那丁與酮康唑合用時(shí)，酮康唑可顯著地抑制特非那丁的代謝，造成特非那丁的血藥濃度顯著升高，可以導(dǎo)致致命的室間心律失常。

圖2為采用肝微粒體技術(shù)研究西尼地平與幾種臨床常用藥物間的代謝相互作用的實(shí)例，結(jié)果表明環(huán)孢素、紅霉素和辛伐他丁在體外表現(xiàn)出對西尼地平代謝的抑制作用，由于三者均是CYP3A的抑制劑或底物，這提示西尼地平與CYP3A的抑制劑或底物合用時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)代謝上的相互作用，使西尼地平的代謝速率降低，西尼地平二氫吡啶環(huán)脫氫代謝物生成減少，而原型藥物的水平顯著提高，這可能會(huì)影響臨床療效的正常發(fā)揮。
 
如果合用的藥物具有潛在的抑制或誘導(dǎo)代謝酶的能力，則前者將受到合用藥物的影響，從而使其代謝清除途徑發(fā)生量化的改變，這種藥物相互作用可能會(huì)影響治療效果，增加藥物的治療失敗率，甚至誘發(fā)不良反應(yīng)。因此，通過對代謝酶表型的體外研究來判定該化合物的主要代謝酶亞型，已成為藥物臨床前代謝研究工作中必不可少的一部分。

2    酶抑制IC50研究試劑盒簡介

參與藥物代謝的CYP450酶主要為CYP1、CYP2和CYP3三個(gè)家族，共有7種重要的亞型，分別為CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4。通過考察不同濃度的藥物對各種酶亞型的特異性底物的代謝速率的影響，得到半數(shù)抑制濃度（IC50），便可評價(jià)藥物對酶的抑制作用。

公司針對酶抑制IC50研究的需要，以肝微粒體體外溫孵法為指導(dǎo)，開發(fā)了一款專門用于酶抑制IC50研究的試劑盒，該產(chǎn)品可直接用于藥物對CYP450活性抑制的的研究，省去了肝微粒體制備和試劑配制的繁瑣過程，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，符合酶抑制IC50研究試驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。

2.1 產(chǎn)品說明

本產(chǎn)品提供了藥物酶抑制（IC50）研究的主要試劑，可直接用于藥物對CYP450酶的半數(shù)抑制濃度（IC50）研究，省去了試劑配制的繁瑣過程，且試劑盒各組成成分經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。

根據(jù)微粒體種屬的不同，可根據(jù)實(shí)際需求選擇人肝微粒體、恒河猴肝微粒體、比格犬肝微粒體、大鼠肝微粒體和小鼠肝微粒體中的一種。
2.2 試劑盒優(yōu)勢

便捷——本試劑盒省去了肝微粒體制備和試劑配制時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。

準(zhǔn)確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。

穩(wěn)定——本試劑盒穩(wěn)定性強(qiáng)、易于運(yùn)輸和保存。
2.4 參考使用方法

2.4.1 試驗(yàn)組

1）冰浴融化試劑盒各組分，置于冰上待用；

2）除微粒體外，將孵育體系其它各組分按照配比混合并吹吸混勻，于37℃預(yù)孵育5min；

3）將以上混合液195μL/管分裝至2.0mL離心管中，于37℃水浴中保溫， 5μL/反應(yīng)加入肝微粒體，吹吸3次混勻于37℃水浴條件下啟動(dòng)代謝反應(yīng)，使用秒表計(jì)時(shí)；

4）于設(shè)定孵育時(shí)間點(diǎn)，向孵育體系中加入終止液終止反應(yīng)（如預(yù)冷乙腈，預(yù)冷乙腈體積：孵育體系體積=1:1）。

例：200μL孵育體系配制：
 
注：
a.體系中有機(jī)溶劑加入量不得大于1%；

b.若實(shí)際需要n個(gè)孵育體系，則需配置n＋1個(gè)體系；

c.本實(shí)驗(yàn)需設(shè)置系列受試物濃度，通常為0μmol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L；

d.參考使用方法僅為使用范例，需根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整。

2.4.2對照組：

無A、B液組：反應(yīng)體系中不加A液和B液，其它組分加入量不變，缺少體積用0.1M PBS緩沖液補(bǔ)齊。

2.4.3結(jié)果計(jì)算：

用各特異性探針底物的代謝物的生成速率反映微粒體孵育體系中各CYP450亞型酶的活性；設(shè)定只含代謝底物的孵育體系中各亞型酶活性為100%，作為對照；樣品中代謝物生成速率相對于對照組生成速率的百分比，作為各亞型酶的剩余活性。

活性剩余百分比 = (某濃度樣品底物代謝物生成速率/零濃度樣品代謝物生成速率) × 100%

2.4.4使用注意事項(xiàng)：

1）試驗(yàn)開始前，請自行準(zhǔn)備2.0mL離心管、不同規(guī)格槍頭、37℃水浴鍋等；

2）本產(chǎn)品僅供科研使用，不能用于人體及動(dòng)物的治療或臨床診斷；

3）使用前，需于冰浴條件下解凍并混合均勻；

4）于-70℃冰箱冷凍保存，切勿反復(fù)凍融；

5）在使用過程中，也可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整試劑盒使用方法和各組分的加入量；

6）因CYP2B6和CYP2C19在體外沒有絕對特異的抑制劑可用，故結(jié)果分析還需結(jié)合其它結(jié)果進(jìn)行，如重組酶法的結(jié)果。

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