timsTOF Pro雙TIMS/PASEF分離技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用

利用質(zhì)譜儀開展的蛋白組學(xué)研究中，質(zhì)譜的掃描速度會(huì)影響蛋白的鑒定深度。與傳統(tǒng)3D蛋白組學(xué)保留時(shí)間、質(zhì)荷比、離子強(qiáng)度相比，timsTOF Pro雙TIMS/PASEF分離技術(shù)，使得蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)入4D蛋白質(zhì)組學(xué)新時(shí)代。4D分離技術(shù)增加第四個(gè)維度—離子淌度（mobility），進(jìn)而大幅提高掃描速度和檢測(cè)靈敏度，提升蛋白鑒定的數(shù)量和覆蓋率。

本期推送用2個(gè)研究案例帶你了解基于timsTOF Pro的4D蛋白質(zhì)組學(xué)到底好在哪？一起來看看吧！

案例一

發(fā)表在Metabolites上的一項(xiàng)題為“Proteomic Analysis of Tears and Conjunctival Cells Collected withSchirmer Strips Using timsTOF Pro: Preanalytical Considerations”的研究采用timsTOF Pro對(duì)淚液及結(jié)膜細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，該研究強(qiáng)調(diào)了結(jié)合高數(shù)據(jù)采集速度和timsTOF Pro中基于離子遷移率的分離，可以為淚液等有限樣本的生物標(biāo)志物研究帶來新的維度[1]。

研究利用timsTOF Pro，采用全面的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究從整個(gè) (W, whole) 淚液檢測(cè)濾紙 (ScS, Schirmer strips) 及其兩個(gè)部分--結(jié)膜囊內(nèi)部分 ( B, bulb) 和濾紙的其余部分 (R, rest of the strip) 采集的樣本的人類蛋白質(zhì)組圖譜。從兩名健康受試者的四次不同就診中收集8個(gè)ScS，分為三批，即4W、4B和4R。在W、B和R批次中總共鑒定出1582種蛋白質(zhì)。在所有已鑒定的蛋白質(zhì)中，結(jié)合蛋白 (43.4%) 和具有催化活性的蛋白 (42.2%) 占分子功能的80%以上。最具代表性的生物過程是細(xì)胞過程 (31.2%) 、代謝過程 (20.8%) 和生物調(diào)節(jié) (13.1%)。酶是最具代表性的蛋白質(zhì)類 (41%)，主要由水解酶 (47.5%)、氧化還原酶 (22.1%) 和轉(zhuǎn)移酶 (16.7%) 組成。與結(jié)膜接觸的部分 (B) 可能由于同時(shí)收集淚液和細(xì)胞蛋白質(zhì)，因此有助于更多蛋白質(zhì)的鑒定。

研究對(duì)來自三組（W、B和R）的所有已鑒定蛋白質(zhì)進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，timsTOF Pro的強(qiáng)大之處在于，它可以分離具有相同質(zhì)量電荷比 (m/z) 的不同分子，圖1顯示了如何通過對(duì)兩個(gè)具有幾乎相同質(zhì)量的靶向肽（白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑和免疫球蛋白）進(jìn)行測(cè)序來評(píng)估肽表征。這些蛋白質(zhì)以相同的保留時(shí)間和非常相似的m/z進(jìn)行共洗脫，但由于timsTOF Pro的三維離子遷移特性，這些肽被區(qū)分開來。

圖1 離子遷移率的可視化熱圖。timsTOF-Pro分析表明，在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，兩種不同蛋白質(zhì)的肽離子具有幾乎相同的質(zhì)量電荷比 (m/z)。圓圈線表示兩個(gè)前體離子的m/z和遷移率位置，這兩個(gè)前體離子通過平行累積連續(xù)碎裂技術(shù) (PASEF) 進(jìn)行碎裂。

案例二

發(fā)表在J ProteomeRes上的一項(xiàng)題為“Ultrafast and Reproducible Proteomicsfrom Small Amounts of Heart Tissue Enabled by Azo and timsTOF Pro”的研究開發(fā)了一種由Azo（一種可光降解、與MS兼容的表面活性劑，可有效溶解蛋白質(zhì)并促進(jìn)快速胰蛋白酶消化）與Bruker timsTOF Pro相結(jié)合的超快全面蛋白質(zhì)組學(xué)方法，該方法通過捕獲離子遷移譜 (TIMS) 和肽的平行累積連續(xù)碎裂技術(shù) (PASEF) 實(shí)現(xiàn)更深的蛋白質(zhì)組覆蓋。研究通過應(yīng)用該方法分析復(fù)雜的人類心臟蛋白質(zhì)組，并在一次高重復(fù)性的一維LC-TIMS-MS/MS運(yùn)行中，從1 mg人類心臟組織中鑒定出近4000個(gè)蛋白質(zhì)組�？偟膩碚f，預(yù)計(jì)這種由Azo和timsTOF Pro相結(jié)合的超快速、穩(wěn)健和可重復(fù)的全面蛋白質(zhì)方法將普遍適用，并大大加快大規(guī)模定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的速度[2]。

文章中提到，由于心臟蛋白質(zhì)組是高度復(fù)雜的，timsTOF Pro增強(qiáng)的敏感性使蛋白質(zhì)組覆蓋范圍更廣。timsTOF Pro在不犧牲靈敏度的情況下，通過PASEF大大提高了MS/MS測(cè)序速度。在這種模式下，從LC柱中共稀釋的離子在TIMS單元中并行累積，根據(jù)其TIMS遷移率分離為離散的數(shù)據(jù)包，然后，結(jié)合快速四極切換，連續(xù)噴射并經(jīng)受MS/MS（圖2B）。該過程顯著增加了從K562全細(xì)胞裂解物消化物中鑒定出的作為參考標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)組和肽的數(shù)量。利用PASEF，研究能夠從三次注射的200 ng K562全細(xì)胞裂解液中鑒定出6364個(gè)蛋白質(zhì)組和60159個(gè)肽，相比之下，在PASEF和TIMS被禁用的同一樣本中，只有2531個(gè)蛋白質(zhì)組和15815個(gè)肽，這說明了PASEF能夠極大地?cái)U(kuò)大蛋白質(zhì)組的覆蓋范圍。

圖2 在timsTOF Pro上使用Azo和PASEF的全面蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程。(A) 樣品制備，包括 (1) 組織切割（可擴(kuò)展至1mg組織），(2) 光降解表面活性劑偶氮中的組織均質(zhì)，(3) 快速胰蛋白酶消化（最快30分鐘），以及 (4) 在 (5) RPLC-TIMS-MS/MS之前的偶氮降解和C18脫鹽。(B) timsTOF Pro上的PASEF示意圖，展示了

SBC 蛋白研究技術(shù)平臺(tái)

SBC擁有業(yè)內(nèi)高水平的蛋白研究技術(shù)平臺(tái)，timsTOF Pro液質(zhì)聯(lián)用儀、Simoa數(shù)字單分子免疫陣列分析儀、ELISA和Western Blot實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)分析和驗(yàn)證，涵蓋蛋白質(zhì)定性、定量和修飾研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Akkurt Arslan M, Kolman I, Pionneau C, et al. Proteomic Analysis of Tears and Conjunctival Cells Collected with Schirmer Strips Using timsTOF Pro: Preanalytical Considerations. Metabolites. 2021;12(1):2. Published 2021 Dec 21. doi:10.3390/metabo12010002

[2]Aballo TJ, Roberts DS, Melby JA, Buck KM, Brown KA, Ge Y. Ultrafast and Reproducible Proteomics from Small Amounts of Heart Tissue Enabled by Azo and timsTOF Pro. J Proteome Res. 2021;20(8):4203-4211. doi:10.1021/acs.jproteome.1c00446