基于納米抗體的免疫熒光探針:用于轉(zhuǎn)移瘤的近紅外二區(qū)NIR-II生物成像

本文要點(diǎn)：傳統(tǒng)的免疫探針具有從可見(jiàn)光到近紅外（NIR-I，650-900 nm）區(qū)域的吸收能力。近紅外二區(qū)（NIR-II，1000-1700 nm）窗口由于更深的穿透深度和可視化而引起了很多關(guān)注。本文報(bào)道一種基于人源納米抗體的免疫熒光探針（ICGM-n501）設(shè)計(jì)與合成，實(shí)現(xiàn)了首次通過(guò)抗原增強(qiáng)熒光發(fā)射的NIR-II生物成像。通過(guò)將ICG類(lèi)似物（ICGM，馬來(lái)酰亞胺修飾）與腫瘤特異性的n501進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)，ICGM-n501以高分辨率（0.21 mm）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)基于抗體的生物制劑的腹部運(yùn)輸途徑，在腹膜轉(zhuǎn)移瘤的生物成像中以更低的劑量（0.21μmol·kg−1）呈現(xiàn)比生物發(fā)光劑D-熒光素更好的準(zhǔn)確性。在這項(xiàng)工作中，ICGM-n501展示了在臨床手術(shù)指導(dǎo)中的潛力，提供了下一代免疫測(cè)定生物制劑的模板。

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n501被設(shè)計(jì)為用于抗體-藥物偶聯(lián)物和診斷試劑的功能性小分子的載體。作者先前基于非免疫健康供體的外周B細(xì)胞創(chuàng)建了一個(gè)大型Fab噬菌體展示抗體庫(kù)，并將篩選出的n501作為5T4靶向納米體。其中一個(gè)位于功能區(qū)外的半胱氨酸殘基用于特定藥物偶聯(lián)，該位點(diǎn)不會(huì)對(duì)該納米體（n501）的功能造成干擾。SDS-PAGE得到了均勻綠色溶液（產(chǎn)量ICGM-n501 = 44.8%）（Figure 1D）。HPLC結(jié)果（Figure 1E）顯示，ICGM-n501有較小的分子量（~501KDa），保留時(shí)間（10.65 min）與n501（10.64 min）相似，表明所得樣品是穩(wěn)定且均勻的溶液。同時(shí)在無(wú)TCEP（穩(wěn)定劑）的PBS溶液中觀察到n501的聚集和解離，表明ICGM的引入增強(qiáng)了n501結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

圖1. ICGM-n501的設(shè)計(jì)、應(yīng)用和特性。（A） ICGM、n501及其共軛產(chǎn)物ICGM-n501的結(jié)構(gòu)示意圖。（B–C）NIR-II生物成像系統(tǒng)和轉(zhuǎn)移瘤時(shí)變生物成像過(guò)程的圖示。（D） n501和ICGM-n501的SDS-PAGE（考馬斯亮藍(lán)染色）。（E） 不含穩(wěn)定劑TCEP、1 mM TCEP和純化產(chǎn)物ICGM-n501的n501的HPLC光譜。（F） 歸一化NIR-I和NIR-II（插圖）ICGM-n501（0.6μM）的熒光發(fā)射光譜以及紫外-可見(jiàn)吸收光譜。NIR-II熒光光譜收集波長(zhǎng)為980 nm 長(zhǎng)通濾波器。

 

本文選用5T4抗原作為轉(zhuǎn)移瘤的靶標(biāo)。n501（1 mM TCEP; IC50 = 0.54μM）和ICGM-n501（1 mM TCEP; IC50 = 0.22μM）顯示出與抗原5T4的良好結(jié)合親和力，而沒(méi)有TCEP穩(wěn)定的n501由于聚集而顯示低親和力（Figure 2A）。相比之下，ICGM、不相關(guān)的免疫試劑ICGM-TH（ICGM修飾的抗酪氨酸羥化酶單克隆抗體）和n118（靶向CD16a）即使在高濃度下也表現(xiàn)出低親和力。這說(shuō)明ICGM本身在抗原抗體結(jié)合過(guò)程中沒(méi)有影響。ICGM-n501與5T4表達(dá)細(xì)胞的特異性親和力通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定評(píng)估。如Figure 2C所示，5T4抗原在卵巢癌PA-1和SKOV-3細(xì)胞系以及人腎上皮293 T細(xì)胞系中高表達(dá)，而在4T1細(xì)胞系中沒(méi)有表達(dá)。當(dāng)測(cè)試這些細(xì)胞系對(duì) ICGM-n501 的攝取時(shí)（Figure 2C），卵巢癌 SKOV-3（3.8）和 PA-1（9.73）細(xì)胞系都呈現(xiàn)出相對(duì)較高的熒光強(qiáng)度。

 

高純度的ICGM-n501促進(jìn)了結(jié)合機(jī)理的研究。添加5T4抗原后，作者首次在NIR-II區(qū)域觀察到ICGM-n501的特定熒光發(fā)射增強(qiáng)（Figure 2D），1050 nm處的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出的非線性遞增曲線（Figure 2D（插圖））。將無(wú)關(guān)抗原s IL-15Rβ, gp140, mesothelin, Tim3- ecd, VEGF分別加入到含有ICGM-n501和飽和5T4抗原（0.267 μmol·L−1）的比色皿中（Figure 2D）,相應(yīng)的熒光發(fā)射光譜幾乎保持不變，1050 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度保持不變，表明ICGM-n501和5T4之間存在特定的連接。然而，在沒(méi)有5T4抗原的情況下，ICGM-n501的熒光光譜存在很大差異（Figure 2E）。

圖2. ICGM-n501的體外生物特性。（A） 基于含或不含TCEP、ICGM-n501、ICGM、ICGM的n501的ELISA數(shù)據(jù)的結(jié)合能力評(píng)估將濃度梯度稀釋至5T4抗原、H7N9 HA抗原的免疫劑TH-ICGM和N118作為陰性對(duì)照。誤差條反映了標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。（B） 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析5T4抗原在不同細(xì)胞系（4T1、SKOV-3、PA-1和293T；每孔1×106）中的表達(dá)抗體（5T4靶向抗體M603、無(wú)關(guān)抗體G12和PBS）結(jié)合能力評(píng)估。（C） 不同細(xì)胞對(duì)ICGM-n501（100 nM）的攝取量直線（4T1、SKOV-3、PA-1和293 T；每孔1×105），（D）ICGM-n501（0.532μmol L）的NIR-II熒光發(fā)射光譜− 1.)添加5T4抗原（4.45nmol L− 1/次），以及ICGM-n501在1050 nm處的5T4抗原濃度依賴(lài)性熒光強(qiáng)度（插圖）。（E） 熒光發(fā)射光譜添加IL-15Rβ、gp140、間皮素、Tim3 ecd和VEGF抗原（4.45 nmol L）后，飽和ICGM-n501結(jié)合5T4抗原− 1.). 插圖顯示熒光燈添加不同抗原后，在1050 nm處發(fā)射ICGM-n501。（E） 添加5T4、IL-15Rβ、gp140、間皮素、Tim3-ecd和VEGF抗原（4.45 nmol L− 1.). 插圖顯示了添加不同抗原后ICGM-n501在1050 nm處熒光發(fā)射變化的比率與僅ICGM-n501相比。使用980 nm長(zhǎng)通濾波器收集NIR-II熒光光譜。

 

現(xiàn)象的機(jī)制總結(jié)如下（Figure 3G）。n501與ICGM的共軛使2-4 Bond保持扭曲角度，以提高TICT過(guò)程的頻率并發(fā)射更長(zhǎng)的波長(zhǎng)。加強(qiáng)Bond 1也略微提升了量子產(chǎn)率。ICGM-n501與5T4抗原進(jìn)一步在膜上結(jié)合產(chǎn)生固定排列，從而提高了膜上5T4抗原的J聚集概率。在此過(guò)程中，5T4抗原作為染料之間分子間能量轉(zhuǎn)移的固相發(fā)揮作用，從而促進(jìn)了熒光發(fā)射強(qiáng)度以及波長(zhǎng)的紅移。

圖3. 抗原促進(jìn)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的機(jī)理分析。（A） 用于高斯計(jì)算的ICGM和ICGM cys的化學(xué)結(jié)構(gòu)。（B） ICGM和ICGM CY的HOMOs和LUMOs。（C） 當(dāng)鍵2扭轉(zhuǎn)0時(shí)，ICGM和ICGM-cys的靜電勢(shì)面（ESP）0°, 55°, 和90°. （D） ICGM和ICGM-cys發(fā)生的TICT（扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移）過(guò)程的圖示。（E） 藥物測(cè)試說(shuō)明。（F） ICGM-n501（0.21μmol kg）后不同時(shí)間（30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)）血清中ICGM-n501的濃度− 1.)靜脈注射到健康小鼠。（G） ICGM-n501的詳細(xì)熒光增強(qiáng)過(guò)程說(shuō)明。

 

應(yīng)用皮下腫瘤模型評(píng)估 ICGM-n501 的腫瘤內(nèi)通路。如Figure 4B、C 所示，通過(guò)腹腔注射0.21 μmol kg-1 ICGM-n501后成功地觀察到 ICGM-n501 的腫瘤通路。作為比較，基于D-熒光素的生物發(fā)光成像需要更多劑量。同時(shí)，ICGM-n501可以提供高分辨率（0.21 mm）圖像。直觀地觀察到ICGM-n501的腹腔內(nèi)遞送途徑，并觀察到它通過(guò)各種類(lèi)型的淋巴結(jié)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)（Figure 4B）。在Figure 4F中，將不同時(shí)間（0 min、12 min和158 min）的 NIR-II 生物成像結(jié)果轉(zhuǎn)換為荷瘤小鼠的 3D 熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)模型，然后基于指示整個(gè) NIR-II生物成像熒光強(qiáng)度的模型計(jì)算 2D 表面體積。2D熒光強(qiáng)度體積從0 min的184940（Figure 4F）增加到 371327（Figure 4G），最后在 926897（Figure 4H）結(jié)束。熒光強(qiáng)度隨著 ICGM-n501 進(jìn)入腫瘤區(qū)域而飆升，這是直觀的證據(jù)表明ICGM-n501與5T4 抗原結(jié)合的作用促進(jìn)了熒光發(fā)射的強(qiáng)度。與靜脈注射相比，ICGM-n501通過(guò)腹膜內(nèi)注射進(jìn)入血流的時(shí)間更長(zhǎng)。158 min時(shí)，NIR-II熒光描繪的腫瘤形狀與基于D-熒光素生物發(fā)光的腫瘤形狀一致。切除腫瘤并H&E染色分析（Figure 4I），顯示與高斯2D擬合的腫瘤大小結(jié)果相似（9 mm×8 mm）（Figure 4H插圖）。綜上所述，ICGM-n501具有高分辨率和腫瘤靶向精確性。

圖4. 通過(guò)ICGM-n501和D-熒光素進(jìn)行皮下腫瘤生物成像。（A） 給雌性裸鼠（9周）注射0.21μmol kg− 1 ICGM-n501之前注射后（B）0分鐘、（C）12分鐘和（D）158分鐘的布萊特菲爾德照片和腹部成像。還顯示了相應(yīng)的三維統(tǒng)計(jì)結(jié)構(gòu)和二維高斯擬合曲線計(jì)算（F–H）。同一只小鼠注射D-熒光素（670μmol kg− 1） 585–735 nm（E）下生物發(fā)光成像前20分鐘。在功率密度為2mw的情況下，使用1200 nm長(zhǎng)通濾波器和808 nm激發(fā)激光進(jìn)行NIR-II生物成像⋅厘米− 2.

 

腹膜轉(zhuǎn)移（PM）通常發(fā)生在患有腹部器官癌癥（如胃癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、闌尾癌和胰腺癌）的患者中，預(yù)后很差。因此，高精度靶向腹膜轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。目前，靶向葉酸受體的OTL-38（3期）和EC-17（1期）是卵巢癌手術(shù)助手僅有的兩個(gè)臨床候選，假陽(yáng)性率為32.7%。ICGM-n501將擴(kuò)大目標(biāo)類(lèi)別和延長(zhǎng)成像窗口。首先通過(guò)生物發(fā)光確定了腹膜轉(zhuǎn)移性腫瘤的位置（Figure 5A）。在Figure 5B中，腹部有七個(gè)明亮的圓形斑點(diǎn)，肝臟位置上方有另外兩個(gè)薄弱點(diǎn)。如Figure 5D所示，ICGM-n501的熒光強(qiáng)度較高，熒光狀區(qū)域呈不規(guī)則狀，與H&E染色呈現(xiàn)的腫瘤形狀一致（Figure 5H，5J-Q）。這些現(xiàn)象表明ICGM-n501在較低劑量 (0.21μmol·kg-1 ) 下顯示出更高的準(zhǔn)確性，部分原因是ICGM-n501-5T4結(jié)合的顯著熒光增強(qiáng)。隱藏在器官中太深肉眼區(qū)分的腫瘤（Figure 5H）被ICGM-n501成功定位和描繪，但在無(wú)創(chuàng)生物成像中D-熒光素卻達(dá)成目標(biāo)。

圖5. 通過(guò)ICGM-n501和D-熒光素進(jìn)行腹膜轉(zhuǎn)移瘤生物成像。將D-熒光素（670）腹腔注射給一只裸鼠（約9周）μmol kg− 1） 在近紅外生物成像儀上以585–735 nm注入后20分鐘，在亮場(chǎng)照片（A）和生物成像（B）之前。顯示了相應(yīng)的2D熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖（F）。同一只小鼠靜脈注射ICGM-n501（0.21μmol kg− 1） 注射后46分鐘，在brightfield photo（C）和NIR-II生物成像（D）之前。相應(yīng)的2D熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)映射如（I）所示。（E） D-熒光素和ICGM-n501的結(jié)構(gòu)、外觀和劑量說(shuō)明。（G） 腹部開(kāi)放的小鼠的亮場(chǎng)，腫瘤可見(jiàn)區(qū)域由橙色虛線環(huán)繞。（H，J-Q）ICGM  n501基于生物成像的組織切除和相應(yīng)的免疫組化分析。在功率密度為2 mw的情況下，使用1200 nm長(zhǎng)通濾波器和808 nm激發(fā)激光進(jìn)行NIR-II生物成像⋅厘米− 2.

 

本文報(bào)告用于NIR-II轉(zhuǎn)移性腫瘤生物成像的全人類(lèi)熒光免疫探針(ICGM n501)。憑借ICGM-n501的均質(zhì)特性，首次在體外和體內(nèi)觀察到由特異性抗原抗體結(jié)合引起的顯著熒光發(fā)射增強(qiáng)，并推斷出TICT和J聚合涉及的兩步機(jī)制。ICGM-n501在皮下腫瘤模型中以高分辨率（0.21 mm）演示了基于抗體的生物制劑的淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)，以低劑量精確定位腹膜轉(zhuǎn)移性腫瘤中的微小病灶（1.38 mm）。總之，ICGM-n501 代表了一種強(qiáng)大的NIR-II生物成像劑、臨床轉(zhuǎn)移性腫瘤的診斷候選物和NIR-II 免疫探針的多功能設(shè)計(jì)模式。

 

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1016/j.biomaterials.2022.121637

 

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