神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及活性的創(chuàng)新分析方案：長(zhǎng)時(shí)程+實(shí)時(shí)定量

 
人的大腦中有數(shù)百億的神經(jīng)元，它是神經(jīng)系統(tǒng)最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位。神經(jīng)元分為胞體和突起（Neurite）兩部分，突起進(jìn)一步分為軸突和樹(shù)突。神經(jīng)元通過(guò)突起與其他神經(jīng)元的樹(shù)突和軸突形成突觸來(lái)進(jìn)行信息傳遞（上圖），與藥物研發(fā)、退行性病變、神經(jīng)損傷再生和神經(jīng)元分化等息息相關(guān)。
   
傳統(tǒng)檢測(cè)神經(jīng)元的方法存在一些局限：

• 在神經(jīng)元成熟的整個(gè)過(guò)程中分析單個(gè)終點(diǎn)（比如免疫組化），不但無(wú)法進(jìn)行重復(fù)的動(dòng)力學(xué)評(píng)估，而且需要進(jìn)行固定、染色、漂洗、采集和分析圖片，步驟繁瑣；
• 也無(wú)法與生理相關(guān)環(huán)境結(jié)合獲取全面信息；
• 無(wú)法確認(rèn)細(xì)胞形態(tài)、空間分辨率或評(píng)估功能的連接性；
• 只能測(cè)定有限數(shù)量的細(xì)胞，無(wú)法模擬真實(shí)的網(wǎng)絡(luò)環(huán)境。

 
 
Incucyte®提供創(chuàng)新型分析方案，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)程、實(shí)時(shí)、連續(xù)的定量監(jiān)測(cè)

Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)可以置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，長(zhǎng)時(shí)程自動(dòng)采集相差和熒光圖片，配合專(zhuān)門(mén)開(kāi)發(fā)的NeuroTrack軟件模塊可以自動(dòng)地完成圖片的定量分析，獲得突起長(zhǎng)度（Neurite length）和分支（Branch points）等反應(yīng)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)變化的指標(biāo)。Incucyte® 的載物臺(tái)里可以同時(shí)檢測(cè)6個(gè)96孔板，滿(mǎn)足高通量實(shí)驗(yàn)需求。不同的用戶(hù)可以通過(guò)局域網(wǎng)在辦公室內(nèi)對(duì)各自的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)設(shè)置、圖片預(yù)覽或定量分析，不需要頻繁出入細(xì)胞間（下圖）。
  究竟有何過(guò)人之處？下面就來(lái)深入了解一下具體的應(yīng)用吧！
 
1  利用實(shí)時(shí)的相差成像來(lái)追蹤不同類(lèi)型神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)

將iPSC來(lái)源的神經(jīng)元iCell、原代大鼠皮層神經(jīng)元和Neuro-2A神經(jīng)元接種到96孔板里，采集間隔為2-6 h，共檢測(cè)150 h。下圖展示了大鼠皮層神經(jīng)元在接種后第0、3和5天的相差圖片，可以看到神經(jīng)元形態(tài)很清晰，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)神經(jīng)元胞體的數(shù)量沒(méi)有明顯改變，但突起的長(zhǎng)度和分支顯著增加。NeuroTrack可以很準(zhǔn)確地識(shí)別和定量神經(jīng)元的突起和胞體，識(shí)別的神經(jīng)突起以黃線(xiàn)圈描，神經(jīng)元胞體以藍(lán)色填充表示。右圖分別展示了三種神經(jīng)元隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)其神經(jīng)突起和分支的時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，都呈上升趨勢(shì)。
  原代、iPSC來(lái)源和神經(jīng)元細(xì)胞系的相差圖片和定量分析結(jié)果

2  記錄將人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為感覺(jué)神經(jīng)元的過(guò)程

Nickolls等人發(fā)現(xiàn)在人多能干細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄過(guò)表達(dá)NGN2-BRN3A后可以有效誘導(dǎo)其分化為感覺(jué)神經(jīng)元⑴。向培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入doxycycline刺激NGN2-BRN3A轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使用Incucyte® 記錄了加藥后第2-5天細(xì)胞形態(tài)的變化過(guò)程。從視頻里我們可以看到神經(jīng)突起在不斷的伸長(zhǎng)，慢慢形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，多能干細(xì)胞樣的形態(tài)逐漸消失變成較大的、圓形神經(jīng)元胞體。
   
3  使用細(xì)胞膜完整性指示劑CytoTox表征谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性

將大鼠前腦原代神經(jīng)元接種在96孔板中，向培養(yǎng)體系中加入333 μM谷氨酸Glutamate，同時(shí)加入Cytotox Red和不同濃度梯度的NMDA受體的拮抗劑MK801，間隔6h采集相差和紅光通道圖片，共檢測(cè)78h。利用標(biāo)準(zhǔn)軟件識(shí)別和定量每個(gè)孔里每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的圖片里帶紅色熒光即已死亡的神經(jīng)元數(shù)量，以采集的時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)得到每個(gè)孔里死亡的神經(jīng)元數(shù)量隨時(shí)間的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)圖。從96孔透視圖里可以很直觀(guān)地看到各組曲線(xiàn)的差異，且相同加藥組孔間的一致性很高（n=5或8），說(shuō)明檢測(cè)的重復(fù)性很好。

從下左、中圖可以看到只加入333 μM谷氨酸組與其他組相比死亡的細(xì)胞數(shù)更多，說(shuō)明谷氨酸的興奮性毒性使原代神經(jīng)元死亡。而加入谷氨酸NMDA受體的拮抗劑MK801后，可以劑量依賴(lài)性降低谷氨酸的興奮性毒性作用，說(shuō)明谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性作用與其N(xiāo)MDA受體有關(guān)。不同濃度梯度的MK801本身不會(huì)對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用（下中圖）。以MK801濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以MK801作用24h后死亡的神經(jīng)元數(shù)量為縱坐標(biāo)生成劑量效應(yīng)曲線(xiàn)，利用Incucyte® 的軟件對(duì)其進(jìn)行擬合得到MK801作用24h時(shí)的IC50=14 nM（右下圖）。
 
4  使用神經(jīng)元標(biāo)記試劑NeuroLight和Annexin V表征神經(jīng)元-膠質(zhì)共培養(yǎng)體系中神經(jīng)元的活性和結(jié)構(gòu)

膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元有支持和保護(hù)功能，下面分享一個(gè)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的應(yīng)用案例。實(shí)驗(yàn)時(shí)先接種大鼠前腦神經(jīng)元，加入紅色NeuroLight試劑孵育4h以特異性地標(biāo)記神經(jīng)元，然后向體系中加入膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，采集間隔為6h，共檢測(cè)13天。從圖E的上圖可以看到體外培養(yǎng)9天后原代神經(jīng)元的胞體和突起均帶有紅色熒光信號(hào)，NeuroTrack準(zhǔn)確地圈描出神經(jīng)元的突起（藍(lán)線(xiàn)）和胞體（綠色填充），定量的結(jié)果顯示神經(jīng)元接種后神經(jīng)突起的長(zhǎng)度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加（圖A）。

在第9天向該共培養(yǎng)體系中加入凋亡指示試劑Annexin V和不同濃度梯度的谷氨酸后，神經(jīng)元突起的長(zhǎng)度開(kāi)始減少且呈濃度依賴(lài)性（下圖A和B），24h時(shí)突起長(zhǎng)度下降最明顯，且在接下來(lái)的近90h的檢測(cè)周期內(nèi)一直沒(méi)有回復(fù)。研究同時(shí)定量了凋亡指示劑Annexin V即綠色熒光信號(hào)的匯合度，也呈劑量依賴(lài)性，且對(duì)谷氨酸更敏感，4.11μM的谷氨酸也有明顯的促凋亡作用。加藥后8h谷氨酸的促凋亡作用最強(qiáng)（見(jiàn)圖E的綠色和黃色信號(hào)），之后信號(hào)開(kāi)始下降，說(shuō)明神經(jīng)元開(kāi)始恢復(fù)，70h后加藥組凋亡信號(hào)與溶劑組一致（見(jiàn)圖C）。比較兩個(gè)指標(biāo)結(jié)果，我們可以發(fā)現(xiàn)谷氨酸對(duì)神經(jīng)元的促凋亡作用是可逆的，但對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)即突起長(zhǎng)度的影響較持久。神經(jīng)元雖然是大腦內(nèi)最小的結(jié)構(gòu)單元，但其對(duì)外界刺激的應(yīng)答是多樣性的。

D圖將24h時(shí)神經(jīng)元突起長(zhǎng)度和8h時(shí)Annexin V對(duì)應(yīng)的劑量效應(yīng)曲線(xiàn)合并到一起，橫軸是谷氨酸濃度的對(duì)數(shù)值，前者隨濃度下降，后者隨濃度增加。軟件根據(jù)劑量效應(yīng)曲線(xiàn)擬合出谷氨酸在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的IC50=16μM和EC50=21μM。
  原代神經(jīng)元-膠質(zhì)共培養(yǎng)體系雙重檢測(cè)可以同時(shí)表征神經(jīng)元活性和結(jié)構(gòu)
 
 
Summary
 
本文分享了Incucyte®、NeuroTrack軟件模塊和無(wú)干擾試劑組合方案在神經(jīng)元單重和共培養(yǎng)體系中的應(yīng)用，通過(guò)實(shí)時(shí)采集和分析圖片可以同時(shí)獲得反應(yīng)神經(jīng)元活性和結(jié)構(gòu)的相關(guān)指標(biāo)，可以導(dǎo)出圖片、視頻、定量曲線(xiàn)、IC50和EC50值。長(zhǎng)時(shí)程動(dòng)態(tài)檢測(cè)可以獲得更加準(zhǔn)確和豐富的信息比如藥物什么時(shí)候起效、什么時(shí)候效應(yīng)最強(qiáng)以及這種效應(yīng)是可逆還是持久的等信息，這些是傳統(tǒng)終點(diǎn)檢測(cè)方法很難做到的。
 
總而言之，Incucyte® 神經(jīng)元分析是一套綜合的解決方案，由儀器、軟件和試劑組成，可對(duì)復(fù)雜的神經(jīng)元活動(dòng)進(jìn)行前所未有的評(píng)估，深入了解神經(jīng)元細(xì)胞模型的功能。

除了研究神經(jīng)元的活性和結(jié)構(gòu)，對(duì)于神經(jīng)元之間信息傳遞的最重要方式——動(dòng)作電位，Incucyte® 也有完整的解決方案，我們會(huì)繼續(xù)為大家分享對(duì)應(yīng)的內(nèi)容的。
 
 
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下載白皮書(shū)《實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)研究中的應(yīng)用》，了解創(chuàng)新型神經(jīng)科研細(xì)胞分析方案。
  
-參考文獻(xiàn)-

⑴ Nickolls AR, Lee MM, Espinoza DF, Szczot M, Lam RM, Wang Q, Beers J, Zou J, Nguyen MQ, Solinski HJ, AlJanahi AA, Johnson KR, Ward ME, Chesler AT, Bönnemann CG. Transcriptional Programming of Human Mechanosensory Neuron Subtypes from Pluripotent Stem Cells. Cell Rep. 2020 Jan 21;30(3):932-946.e7. doi: 10.1016/j.celrep.2019.12.062. PMID: 31968264; PMCID: PMC7059559.