FV3000共聚焦和微流控實(shí)現(xiàn)釀酒酵母單細(xì)胞復(fù)制壽命檢測(cè)

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本期推出【FV3000 Makes Yeast Evident】

 

東南大學(xué)電子科學(xué)與工程學(xué)院 MEMS教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

 

釀酒酵母與復(fù)制壽命檢測(cè)

細(xì)胞及生物體的衰老是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，通常被認(rèn)為是由分子、細(xì)胞和器官的損傷不斷積累造成。
釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），又稱出芽酵母（Budding yeast），作為首個(gè)實(shí)現(xiàn)完整基因組測(cè)序的模式真核細(xì)胞，具有繁殖迅速、培養(yǎng)條件簡單、基因組小等優(yōu)點(diǎn)，并且與人類的衰老曲線相似，成為衰老壽命研究的理想模型。
釀酒酵母在死亡之前只能產(chǎn)生有限數(shù)量的子細(xì)胞，這種現(xiàn)象被稱為復(fù)制衰老，而在死亡前產(chǎn)生的子細(xì)胞的數(shù)量被稱為復(fù)制壽命（Replicative Lifespan, RLS）。

B 酵母細(xì)胞復(fù)制壽命示意圖[2]

酵母細(xì)胞復(fù)制壽命的傳統(tǒng)測(cè)量手段是基于1959年提出的微解剖法，即利用微解剖針手動(dòng)剔除培養(yǎng)板上單個(gè)酵母細(xì)胞產(chǎn)生的每代子細(xì)胞，從而得到復(fù)制壽命。該方法具有效率低、周期長、樣本量小、對(duì)細(xì)胞易造成損傷等缺點(diǎn)。

而微流控芯片可利用微結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)酵母單細(xì)胞的捕獲，利用流體力剪切去除子細(xì)胞，為釀酒酵母自動(dòng)化高通量單細(xì)胞培養(yǎng)和高時(shí)空分辨率監(jiān)測(cè)提供可能，但有如下局限：

• 現(xiàn)有微流控芯片在細(xì)胞捕獲穩(wěn)定性、子細(xì)胞剪切效率、復(fù)制壽命檢測(cè)精確性等方面都有待于提高；

• 現(xiàn)有微流控芯片較少關(guān)注大體積、隨機(jī)出芽的雙倍體酵母細(xì)胞的捕獲培養(yǎng)和壽命檢測(cè)。

顯微成像技術(shù)在課題研究中的作用

東南大學(xué)電子科學(xué)與工程學(xué)院MEMS教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室朱真副教授團(tuán)隊(duì)利用高通量微流控芯片取得了釀酒酵母單細(xì)胞復(fù)制衰老壽命研究的重要進(jìn)展，相關(guān)研究成果于3月31日以“A high throughput microfluidic diploid yeast long term culturing (DYLC) chip capable of bud reorientation and concerted daughter dissection for replicative lifespan determination”為題，發(fā)表在國際期刊Journal of Nanobiotechnology上（影響因子：10.435，doi：/10.1186/s12951-022-01379-9）。

該論文研制的高通量釀酒酵母單細(xì)胞捕獲-培養(yǎng)-解剖微流控芯片，與奧林巴斯FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡雙劍合璧，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)雙倍體釀酒酵母母細(xì)胞的可靠捕獲和子細(xì)胞的一致性剪切，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的長期培養(yǎng)和完整的復(fù)制壽命檢測(cè)研究。

針對(duì)不同“瓶身”長度，時(shí)序圖像顯示在母細(xì)胞較小時(shí)，捕獲結(jié)構(gòu)容易捕獲上游剪切下的細(xì)胞。而母細(xì)胞接近凋亡時(shí)，由于體積增大，子細(xì)胞旋轉(zhuǎn)至“瓶頸”的成功率降低，朝向“瓶身”上游生長的子細(xì)胞會(huì)將母細(xì)胞拖拽造成樣本丟失。根據(jù)統(tǒng)計(jì)的母細(xì)胞穩(wěn)定保持的比例，最終確定“瓶身”長度優(yōu)化值。

A 4小時(shí)內(nèi)微捕獲陣列中的空結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)“自填充”

B 4小時(shí)內(nèi)單細(xì)胞捕獲效率提升

C 較短“瓶身”的捕獲結(jié)構(gòu)，朝向上游的子細(xì)胞將母細(xì)胞拖拽造成樣本丟失

D 較長“瓶身”的捕獲結(jié)構(gòu)，易捕獲上游剪切下的細(xì)胞

接下來，研究人員在高通量單細(xì)胞長時(shí)間培養(yǎng)過程中，通過視頻拍攝觀測(cè)并驗(yàn)證了母細(xì)胞在初始出芽時(shí)的動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)，并在芽稍大時(shí)重新定向至“瓶頸”處，且停止旋轉(zhuǎn)直到胞質(zhì)分裂完成后被解剖分離。通過時(shí)序成像，驗(yàn)證了母細(xì)胞在多代子細(xì)胞之間，面臨隨機(jī)的出芽位點(diǎn)依然能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的“瓶頸”定向和子細(xì)胞剪切。

同時(shí)，釀酒酵母的細(xì)胞周期在其壽命內(nèi)的分布也呈現(xiàn)一定規(guī)律。細(xì)胞在完成第一個(gè)細(xì)胞周期的用時(shí)比接下來5代用時(shí)略長，而接下來的復(fù)制壽命里，各代周期皆相對(duì)平穩(wěn)，只在臨近死亡的最后幾代中急劇上升。選取樣本并將其每個(gè)細(xì)胞周期使用不同顏色的長條標(biāo)出，從而將細(xì)胞群體間的異步化結(jié)果變得可視化。

結(jié)果表明，細(xì)胞在前8至10代以內(nèi)，細(xì)胞周期在細(xì)胞相互間保持有相對(duì)的同步性，隨著細(xì)胞不斷衰老，細(xì)胞間的異質(zhì)化現(xiàn)象逐漸明顯。臨近細(xì)胞死亡時(shí)，細(xì)胞的周期被拉長，且細(xì)胞間差異逐漸擴(kuò)大。

A 雙倍體釀酒酵母細(xì)胞的復(fù)制壽命曲線

B 不同時(shí)間點(diǎn)下，母細(xì)胞所產(chǎn)生的子細(xì)胞被空捕獲結(jié)構(gòu)捕獲后的復(fù)制壽命

C 釀酒酵母細(xì)胞的平均細(xì)胞周期（出生對(duì)齊）

D 釀酒酵母細(xì)胞的平均細(xì)胞周期（死亡對(duì)齊）

E 細(xì)胞周期分布圖

該研究后續(xù)工作包括利用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)深度學(xué)習(xí)算法實(shí)現(xiàn)酵母細(xì)胞的復(fù)制壽命、細(xì)胞周期、生長速率等關(guān)鍵生理指征參數(shù)的高效智能分析，成功解決酵母細(xì)胞衰老過程中的表型分析問題，為釀酒酵母復(fù)制壽命及其衰老相關(guān)形態(tài)變化完整關(guān)聯(lián)性圖譜的構(gòu)建提供可能，并在雜合性缺失、沉默信息調(diào)控等雙倍體細(xì)胞獨(dú)有的壽命調(diào)控模式研究上具有廣泛的前景。

在成像樣品制備以及圖像采集中的注意事項(xiàng)

參考文獻(xiàn)

[1] Smith, J., Wright, J., & Schneider, B. L. (2015). A budding yeast's perspective on aging: The shape I'm in. Exp Biol Med, 240(6), 701-710.

[2] Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H. E. W., Lee, L. P., & Heinemann, M. (2012). Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci USA, 109(13), 4916-4920.