細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的技術(shù)原理和操作步驟

細(xì)胞凍存與細(xì)胞復(fù)蘇，是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的常見工作。

細(xì)胞凍存，是指將細(xì)胞貯存在超低溫環(huán)境中，使細(xì)胞暫時(shí)“冬眠”的技術(shù)，在需要的時(shí)候再進(jìn)行復(fù)蘇。

細(xì)胞復(fù)蘇，是把凍存在-80℃冰箱或液氮中的細(xì)胞快速解凍，并使細(xì)胞重新恢復(fù)生長的技術(shù)。

細(xì)胞凍存篇

凍存原則

細(xì)胞凍存原則為“慢凍”，即讓細(xì)胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。

如果直接將細(xì)胞懸液放在超低溫下快速冷凍，細(xì)胞會(huì)受到冷凍損傷而死亡。在凍存液中添加的保護(hù)劑（如DMSO、甘油）和在凍存盒中添加的異丙醇，都起到程序性降溫的作用。

DMSO使用注意事項(xiàng)

DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，延緩溫度下降速度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

需注意的是，DMSO溶于培養(yǎng)基時(shí)，將釋放大量熱量，所以細(xì)胞凍存液需提前配制，不能直接將DMSO加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，避免燙傷細(xì)胞。

另外，DMSO屬于致癌物質(zhì)，使用時(shí)應(yīng)戴好手套，規(guī)范操作。

程序凍存液配方

程序凍存液成分一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO組成。血清比例為10%~90%，DMSO比例為5%~10%。根據(jù)普諾賽實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，推薦凍存液配比：55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋40%胎牛血清＋5%DMSO，難養(yǎng)細(xì)胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO凍存。

細(xì)胞凍存密度

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過程中，不可避免會(huì)損失部分細(xì)胞，所以凍存的密度不能太低。提高凍存密度有助于提升細(xì)胞復(fù)蘇存活率，推薦密度為100~300萬細(xì)胞/mL。

凍存操作方法

方法一：使用程序凍存盒

使用程序降溫盒是最常用的凍存方法。市面上的降溫盒有些需要添加異丙醇，有些則不需要。

降溫盒須恢復(fù)室溫后再使用。

根據(jù)普諾賽實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，使用程序凍存盒凍存效果良好，沒有凍存盒的同學(xué)可以參照下文方法二和方法三。

操作步驟

步驟1：配制程序凍存液，放在室溫備用或放在4℃預(yù)冷

步驟2：離心收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（貼壁細(xì)胞消化下來離心，懸浮細(xì)胞直接離心，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g，時(shí)間3min）

步驟3：用配制好的凍存液重懸細(xì)胞，按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中，擰緊管蓋，做好標(biāo)記

步驟4：凍存管放入凍存盒，凍存盒放入-80℃冰箱過夜（24h）

步驟5：凍存管從凍存盒取出，轉(zhuǎn)移至液氮長期保存

方法二：使用無血清非程序凍存液

無血清非程序凍存液是一種商品化的凍存液，無需自己配制，無需降溫盒，大大提升了便捷性。

但是，并非所有細(xì)胞都適用于這種凍存液，使用前必須做凍存測(cè)試，沒問題后再批量應(yīng)用。

操作步驟

步驟1：從冰箱拿出無血清非程序凍存液，待用

步驟2：離心收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（貼壁細(xì)胞消化下來離心，懸浮細(xì)胞直接離心，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g，時(shí)間3min）

步驟3：棄上清，加入適量無血清非程序凍存液，重懸細(xì)胞

步驟4：按照1~1.5mL/管的量分裝到凍存管中，擰緊管蓋，做好標(biāo)記

步驟5：將凍存管直接移入-80℃冰箱中，24h后轉(zhuǎn)移至液氮長期保存

方法三：手動(dòng)梯度降溫

在沒有凍存盒或者非程序凍存液時(shí)，可以選擇手動(dòng)梯度降溫。但手動(dòng)梯度降溫不適用于所有細(xì)胞，且效果不穩(wěn)定，同樣需要先做凍存測(cè)試。

操作步驟

步驟1：配制程序凍存液，放在室溫備用或放在4℃預(yù)冷

步驟2：離心收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（貼壁細(xì)胞消化下來離心，懸浮細(xì)胞直接離心，轉(zhuǎn)速1200rpm或250g，時(shí)間3min）

步驟3：用配制好的凍存液重懸細(xì)胞，按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中，擰緊管蓋，做好標(biāo)記

步驟4：凍存管按照【4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（24h）→液氮】的順序放置

細(xì)胞復(fù)蘇篇

細(xì)胞復(fù)蘇講究“快融”，越快融化，細(xì)胞所受損傷就越小。細(xì)胞復(fù)蘇的操作不復(fù)雜，但每一步都必須穩(wěn)扎穩(wěn)打，才能最大限度地提高復(fù)蘇存活率。

細(xì)胞復(fù)蘇步驟

步驟1：水浴鍋預(yù)熱至37℃?zhèn)溆?br />
步驟2：準(zhǔn)備15mL離心管，并向其中加入適量培養(yǎng)基待用

（小貼士：離心管中加入2~9mL的培養(yǎng)基，比較難養(yǎng)的細(xì)胞，可適量增加培養(yǎng)基。）

步驟3：將細(xì)胞凍存管從-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入水浴鍋

（小貼士：如果冰箱或液氮距離水浴鍋路途較遠(yuǎn)（步行超過1min），要把細(xì)胞先置于干冰上，再送至水浴鍋。如果將細(xì)胞凍存管直接放在手上或口袋里，可能導(dǎo)致溫度逐漸回升而產(chǎn)生冰晶損傷細(xì)胞。而將細(xì)胞凍存管裝在PE手套中，是為了預(yù)防污染。）

步驟4：用力搖晃凍存管，使其在1分鐘內(nèi)融化

（小貼士：這一步越快融化越好，最好能放計(jì)時(shí)器在旁邊。如果1分鐘內(nèi)沒有融化，可能是凍存液量偏多，或者搖晃力度不夠。）

步驟5：用紙巾擦拭水漬，轉(zhuǎn)移至生物安全柜。用移液槍吸取細(xì)胞懸液，緩慢滴加到步驟2中準(zhǔn)備好的離心管

（小貼士：當(dāng)同時(shí)復(fù)蘇多管細(xì)胞時(shí)，注意不要弄混。）

步驟6：1200rpm離心3分鐘

（小貼士：離心是為了去除DMSO，對(duì)于DMSO敏感的細(xì)胞，必須離心；若復(fù)蘇的細(xì)胞對(duì)DMSO不敏感，步驟6、步驟7可以省略，直接將培養(yǎng)基補(bǔ)足至10mL，接種至培養(yǎng)器皿中，第二天換液。）

步驟7：棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至新的無菌培養(yǎng)器皿中

做完步驟7，細(xì)胞就復(fù)蘇好了。復(fù)蘇的細(xì)胞需要一段時(shí)間恢復(fù)狀態(tài)，當(dāng)復(fù)蘇后的細(xì)胞密度低于80%時(shí)，48小時(shí)內(nèi)不要換液，待細(xì)胞形態(tài)、生長速度等恢復(fù)正常，再進(jìn)行細(xì)胞傳代等操作。（不要因?yàn)閺?fù)蘇后兩三天細(xì)胞狀態(tài)不好就丟棄，應(yīng)耐心等待至少一周。）