1200nm的NIR-II新型黃蒽染料應(yīng)用：高效的腫瘤血管造影和光熱治療

本文要點(diǎn)：光熱療法(PTT)是一種通過局部熱療誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死的非侵入性治療方法，具有有效腫瘤殺傷力，但是NIR-II PTT治療作用的增加依賴于非輻射衰減，這會犧牲熒光(FL)生物成像的熒光亮度。本文合成了四種NIR-II黃蒽染料(CL1-CL4)，在1064nm激發(fā)下，最大發(fā)射波長超過1200nm。其中，CL4與FBS絡(luò)合后熒光量子產(chǎn)率最大，能夠清晰分辨出腫瘤血管，而且光熱轉(zhuǎn)換率（PCE）高達(dá)36%，可用于PTT治療，成功在NIR-II窗口實(shí)現(xiàn)熒光成像和光熱治療在的平衡利用。

 

 

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方案1：CL4/FBS的構(gòu)建示意圖、平衡利用熒光和光熱用于腫瘤血管造影和光熱治療。

 

CL4與FBS絡(luò)合后，在1064nm的激光照射下，可以同時實(shí)現(xiàn)在NIR-II窗口中的熒光成像和PTT治療。

 

圖1：a) CLs的分子結(jié)構(gòu)。b) CLs的HOMO軌道和LUMO軌道。c)通過密度泛函理論(DFT)計(jì)算優(yōu)化CLs的幾何形狀。d)CLs在氯仿中的吸收光譜。e)氯仿中CLs在1064 nm激發(fā)下的歸一化發(fā)射光譜。

 

表1：CLs的光物理性質(zhì)和DFT計(jì)算

 

首先，研究CLs的光譜性質(zhì)。CLs在1200 nm附近有較寬的吸收帶，并且在1064nm的激發(fā)下，CLs的最大發(fā)射波長均超過1200 nm (表1、圖1d和1e)。這主要?dú)w因于兩個氧雜蒽核與聚甲基橋的融合，導(dǎo)致分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)效應(yīng)顯著增強(qiáng)。其中CL4具有最大的Egap、分子扭曲和熒光量子產(chǎn)率(圖1b、1c和表1)。這是因?yàn)閷�CF3引入巰基的鄰位，導(dǎo)致分子內(nèi)空間位阻大，削弱了分子的自由旋轉(zhuǎn)，增加了輻射衰減。

 

圖2：a) CL4與FBS在1064nm激發(fā)下孵育0-120 min，隨時間變化的發(fā)射光譜。b) CLs與FBS孵育0-120分鐘，CL2 ~ CL4熒光強(qiáng)度的變化。c-d) CL4/FBS和CL4-水的吸收光譜(c)和發(fā)射光譜(d)。e) CL4/ FBS的透射電鏡(TEM)圖像。f-g) CL4/FBS和FBS的水動力直徑(f)和zeta電位(g)。h) CL4/FBS的pH穩(wěn)定性。i) CL4/FBS和ICG 的光穩(wěn)定性。

 

接下來，研究CLs/FBS的性質(zhì)。將CLs與FBS絡(luò)合，可以提高自身的熒光強(qiáng)度和親水性。如圖2b-2d所示，與FBS絡(luò)合后，CLs的最大吸收波長發(fā)生紅移，最大發(fā)射波長略微藍(lán)移，其中CL4的熒光強(qiáng)度比CL2或CL3提高了3倍以上，這可能歸因于CL4的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)容易受到限制。接著進(jìn)一步表征CLs/FBS的基本性質(zhì)，如圖2e-2g所示，CL4/FBS的粒徑均勻，TEM測定的粒徑約為40nm，DLS測得的粒徑為64nm；并且CL4/FBS的電動電勢與FBS相當(dāng)。這些結(jié)果表明CLs/FBS具有通過高滲透長滯留(EPR)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)被動靶向腫瘤的可能性。此外，CL4/FBS還具有PH穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性(圖2h和圖2i)。

 

圖3：a) CL4/FBS在1064 nm激光照射下的升溫曲線。b)冷卻時間與的線性關(guān)系。c)在不同時間下，CL4/FBS隨著濃度變化的溫度曲線。d)在1064 nm激光照射10分鐘后，CL4/FBS濃度依賴性的熱圖像。e)在不同激光功率下，CL4/FBS隨時間變化的溫度曲線。f)在不同激光功率連續(xù)照射30 min下，CL4/FBS的光穩(wěn)定性。g) CL4/FBS在5個加熱-冷卻循環(huán)中的光熱穩(wěn)定性。

 

接著，研究CL4/FBS的光熱性能。如圖3a-3b所示，CL4/FBS的PCE高達(dá)36%，而CL4在水中的PCE僅為19%，所以與FBS絡(luò)合不僅提高熒光強(qiáng)度，也提高了PTT的治療效果。如圖3c-3d所示，在同樣條件激光照射下，水溫度只升高了9.8℃，而CL4/FBS溫度上升更顯著，并且表現(xiàn)出濃度依賴性。同樣，隨著激光功率的增加，CL4/FBS溶液溫度也隨之增加(圖3e)。這些結(jié)果都表明了CL4/FBS具有良好的體外光熱性能。另外，CL4/FBS還具有良好的光熱穩(wěn)定性(圖3f和3g)，可以繼續(xù)進(jìn)一步PTT的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

 

圖4：a) 4T1細(xì)胞與CL4/FBS孵育4 h后，明場、核染色和 NIR-II FL的圖像。b) 與CL4/FBS孵育，無/有激光照射的4T1細(xì)胞的存活率。c)不同條件下活/死細(xì)胞共染色的共聚焦圖像。

 

緊接著，在體外研究CL4/FBS的PTT效果。首先研究CL4/FBS的細(xì)胞攝取，如圖4a所示，與CL4/FBS孵育4h之后，4T1細(xì)胞中可觀察到明亮的NIR-II熒光，而細(xì)胞核中沒有發(fā)現(xiàn)熒光，說明CL4/FBS具有良好的細(xì)胞攝取能力。隨后研究CL4/FBS的細(xì)胞毒性，如圖4b所示，CL4/FBS具有良好的生物相容性，而與CL4/FBS孵育并在激光照射下4T1細(xì)胞的死亡率逐漸增加，說明CL4/FBS具有出色的激光觸發(fā)的熱效應(yīng)。另外，如圖4c所示，只有PTT組，表現(xiàn)出明顯的紅色熒光，說明細(xì)胞被有效殺滅。這些結(jié)果表明，CL4/FBS具有良好的光熱治療效果。

 

圖5：a）靜脈注射CL4/FBS后0、20、30、40min腫瘤血管的NIR-II FL。b-d）(a)中線1、線2和線3橫截面的強(qiáng)度分布圖。e)靜脈注射CL4/FBS后，(a)中A區(qū)和B區(qū)分別在20、30和40 min的平均熒光強(qiáng)度。

 

接下來，通過NIR-II FL研究腫瘤血管最基本的性質(zhì)。現(xiàn)有的非侵入性成像方法難以獲得腫瘤血管的本質(zhì)特征。然而如圖5a所示，靜脈注射CL4/FBS后，腫瘤血管清晰明亮。線1和線2是腫瘤血管的橫切面，線3是正常血管的橫切面，對比它們的半峰寬(FWHM)，可以看出在腫瘤發(fā)生的前期的血管比正常血管要細(xì)得多(5b-5d)。另外，如圖5e所示，A區(qū)的熒光強(qiáng)度低于B區(qū)，這歸因于腫瘤血管的異常滲漏結(jié)構(gòu)，表明腫瘤穿透具有復(fù)雜的異質(zhì)性。這些結(jié)果表明CL4/FBS具有良好的NIR-II腫瘤血管造影的能力。

 

圖6：a) 4T1荷瘤小鼠靜脈注射CL4/FBS和CL4后全身NIR-II 熒光成像，以及不同時間靜脈注射CL4/FBS后腫瘤的放大圖。b) (a)中腫瘤NIR-II FL強(qiáng)度的量化。c) 靜脈注射CL4/FBS和CL4 48小時后，主要器官和腫瘤離體NIR-II的熒光成像。d）(c)中主要器官和腫瘤強(qiáng)度的量化。

 

接下來，研究CL4/FBS在腫瘤中的富集。如圖6a-6b所示，靜脈注射CL4/FBS后，腫瘤亮度逐漸升高，注射32 h后腫瘤亮度最大，而靜脈注射CL4后，在腫瘤部位幾乎沒有觀察到NIR-II熒光。之后研究小鼠的主要器官和腫瘤，發(fā)現(xiàn)CL4/FBS比CL4更有效地在腫瘤中富集；此外，CL4/FBS和CL4在肝臟和脾臟均有積累，表明可能它們在體內(nèi)的代謝途徑是肝膽系統(tǒng)(圖6c-d)。這些結(jié)果表明CL4/FBS可作為一種有效的NIR-II熒光劑用于腫瘤成像。

 

圖7：a）激光組和PTT組隨時間變化的小鼠時間分辨紅外熱像圖。b）不同組別腫瘤溫度變化。c）不同治療后14 天內(nèi)小鼠腫瘤體積的變化。d）不同處理后第0天和第14天的小鼠照片。e）第14天腫瘤的照片。f）第14天腫瘤的重量。g）不同處理14天后的小鼠體重。h）不同治療后腫瘤切片的H&E、Ki67、TUNEL染色圖像。

 

最后，進(jìn)行體內(nèi)NIR-II PTT研究。按治療方式分為4組:①對照組；②CL4/FBS組；③激光組;④PTT組。如圖7a-7b所示，PTT組腫瘤溫度迅速升高，而其他組腫瘤溫度沒有明顯變化。接著，檢測腫瘤的體積和重量，發(fā)現(xiàn)只有PTT組的腫瘤生長明顯受到抑制(圖7c-7f)。說明CL4/FBS的PTT具有良好的腫瘤抑制活性。并且如圖7g所示，在治療期間，各組小鼠體重變化可以忽略不計(jì)，說明各組都沒有明顯不良反應(yīng)。接下來，進(jìn)一步探討PTT對腫瘤生長的抑制機(jī)制，如圖7h所示，PTT組腫瘤組織H&E染色圖像顯示出腫瘤細(xì)胞嚴(yán)重凋亡和壞死，Ki67和TUNEL免疫熒光染色圖像顯示了腫瘤細(xì)胞輕度增殖和明顯的凋亡信號，結(jié)果證實(shí)了CL4/FBS的PTT對腫瘤有較好的抑制作用。

 

總結(jié)：作者合成了4種發(fā)射波長超過1200 nm的NIR-II新型黃蒽染料CLs。其中CL4與FBS絡(luò)合后，具有最強(qiáng)的熒光強(qiáng)度和最高的PCE。在NIR-II FL成像中，可以清晰呈現(xiàn)出腫瘤血管，并且可以明顯抑制腫瘤的生長，成功實(shí)現(xiàn)了平衡利用熒光成像和PTT治療。

 

 

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1002/smll.202202078.

 

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